免疫抑制法检测肌酸激酶同工酶MB临床应用评价*

陈闻达，李懿皞，朱晶，邵文琦，王蓓丽，2，郭玮，2

(1.复旦大学附属中山医院检验科，上海200032；2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建厦门361015)

流行病学调查指出，在未来一段时间内，心血管疾病仍将是城乡居民最主要死亡原因之一[1]。肌酸激酶(creatine kinase, CK)和CK同工酶MB(creatine kinase isozyme MB, CK-MB)是经典的心肌标志物，在急性心肌梗死等急性冠脉综合征的诊断及心肌手术的术后监测上有着较为广泛和成熟的应用[2]。免疫抑制法是当下CK-MB临床检测中应用较为广泛的方法，由于常规试剂盒中仅加入抗人CK-M亚基单克隆抗体，在常规临床检测中可能会出现CK-MB含量大于CK的情况，即CK与CK-MB结果倒置现象(简称“CK结果倒置”)。为了改善这一情况，有部分厂商也选择在试剂盒中添加抗人线粒体型CK(mitochondrial creatine kinase, MtCK)单克隆抗体，但目前尚无验证这类试剂盒性能的报道。因此，本研究选择了一款添加了抗人MtCK单克隆抗体的免疫抑制法CK-MB检测试剂盒进行性能验证，同时对收集的CK结果倒置的标本进行回顾性分析。

1 对象和方法

1.1研究对象

1.1.1健康人对照组 选择2020年8月至9月在复旦大学附属中山医院体检中心体检的表观健康人50例作为健康人对照组。经影像、超声及体格检查排除高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤等疾病，肝肾功能正常且免疫学检查无肿瘤标志物升高。所有标本无明显的溶血、脂血及黄疸。

1.1.2心血管疾病组 选择2020年8月至9月就诊于复旦大学附属中山医院、确诊为心血管疾病并进行CK、CK-MB检测的50例患者作为心血管疾病组。所有患者均已签署知情同意书。此外，收集2020年8月至10月就诊于复旦大学附属中山医院进行CK、CK-MB检测并报告“CK浓度小于CK-MB浓度”的28例患者。

1.2主要仪器与试剂 日立公司7600-030型全自动生化分析仪及世诺公司CK-MB测定试剂盒用于验证，罗氏公司cobas c702全自动生化分析仪及配套的CK-MB检测试剂盒、CK检测试剂盒用于对照；CK同工酶电泳采用法国Sebia公司的HYDRASYS电泳仪及专用的CK同工酶电泳试剂盒。

1.3标本采集与处理 用BD含惰性分离胶促凝剂的真空血清采血管采集静脉血标本，室温静置30 min后，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min分离血清，分装后冻存于-80 ℃。

1.4方法学性能验证

1.4.1正确度验证 选择与校准不同批号的校准品(1水平)及2020年全国心肌标志物室间质评物202021、202022、202023、202024、202025(2至6水平)分别重复检测3次，计算均值及相对偏倚，观察相对偏倚是否在厂商声明的可接受范围(15%)内。

1.4.2精密度验证 选择高、中、低3个水平的定值质控品，每日分别检测5次，连续检测5 d，计算其不精密度，观察其不精密度是否在厂商声明的可接受范围(7%)内。

1.4.3线性范围验证 选取已知CK-MB活性的高值和低值标本，按不同比例稀释，配制成5个不同浓度的混合血清，每个浓度分别检测3次，计算其均值作为实测值。根据CNAS-GL037要求进行多项回归分析，并对非线性系数作t检验，判断非线性系数与0差异是否有统计学意义，如无差异则表示回归方程为一阶线性。

1.4.4最大稀释比验证 选取已知CK-MB活性的高值标本1例，梯度稀释至试剂盒声明的最大稀释倍数，得到5个不同浓度的稀释标本。每个稀释标本分别检测3次，计算其均值及相对偏倚，观察其相对偏倚是否在厂商声明的可接受范围(10%)内。

1.4.5参考区间验证 选择2020年8月至9月在复旦大学附属中山医院体检中心体检的健康人50例作为参考区间验证组。年龄18～65周岁，男女比例为1∶1。经影像、超声及体格检查排除高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤等疾病，肝肾功能正常且免疫学检查无肿瘤标志物的升高。所有标本无明显的溶血、脂血及黄疸。观察所有数据的第95百分位数是否位于厂商声明的参考区间(≤12 IU/L)内。

1.5临床应用评价 健康人对照组和心血管疾病组标本分别用世诺公司CK-MB测定试剂盒进行检测，并评价对比试剂盒在心血管疾病患者中的应用与诊断效能。

选取临床报告“CK浓度小于CK-MB浓度”，即CK结果倒置的患者血清标本28份，分别先用世诺公司CK-MB测定试剂盒进行检测，对比其检测结果与罗氏公司CK-MB检测试剂盒的结果，观察患者CK结果倒置情况是否被纠正。随后，用Sebia公司CK同工酶电泳试剂盒对上述标本血清进行检测及验证。

2 结果

2.1正确度验证 1水平的定值校准品的重复检测均值为91 IU/L，与定值(90 IU/L)间的偏倚为1.11%，小于厂商声明的可接受范围(15%)。室间质评物202021、202022、202023、202024、202025重复检测的均值分别为13、84、159、50、127 IU/L，与各自靶值(12.44、82.03、165.33、49.13、120.05 IU/L)的相对偏倚分别为4.5%、2.4%、-3.8%、1.8%、5.8%，均位于室间质评报告提供的允许范围内。

2.3线性范围验证 二阶方程非线性系数b2及三阶方程非线性系数b2、b3均与0差异无统计学意义，表明在1.6～1 050 IU/L范围内，试剂盒线性良好，符合厂商声明的线性范围。

2.4最大稀释比验证 选取已知CK-MB活性的标本(1 046.7 IU/L)，经1∶2、1∶4、1∶8和1∶10稀释后分别进行检测，所得结果与理论值之间的相对偏倚分别为0%、0.9%、3.1%、6.5%和8.9%。所得结果的相对偏倚均小于厂商要求的相对偏倚(10%)，表明试剂盒满足厂商声明的最大稀释比(1∶10稀释)的性能要求。

2.5参考区间验证 50例样本结果分布于2～10 IU/L内，第95百分位数值为9 IU/L，满足厂商声明的参考区间。

2.6临床应用评价

2.6.1对心血管疾病的检测效能 健康人对照组年龄为(47.1±10.2)岁，男性36名，占72%；病例组年龄为(57.6±18.1)岁，男性36名，占72%。两组患者世诺公司CK-MB测定试剂盒的检测结果分别为(5.88±1.35) IU/L和(135.42±93.21) IU/L，差异有统计学意义(t=-9.826，P<0.01)。

2.6.2对CK结果倒置的校正情况 28例临床报告为CK结果倒置的患者中,有10例经世诺公司CK-MB测定试剂盒检测后，结果得到校正，CK同工酶电泳结果也显示患者存在明显的巨CK-Ⅱ(主要组成为线粒体CK)条带。但该10例中有2例患者CK倒置结果仅得到部分校正，纠正后CK结果仍然倒置但程度减轻。经CK同工酶电泳结果显示，患者体内除巨CK-Ⅱ外，还存在CK-BB(见图1A)；剩余18例的CK倒置结果未得到校正，CK同工酶电泳结果显示，患者存在明显的巨CK-Ⅰ条带(见图1B)，说明患者的CK结果倒置情况主要由巨CK-Ⅰ导致。表明采用添加了MtCK抑制剂的CK-MB检测试剂盒能较好地纠正由于MtCK的存在引起的CK倒置情况，而由巨CK-Ⅰ等其他亚型的CK同工酶存在引起的CK结果倒置，则可能仍需通过CK同工酶电泳的方式进行辨认。

注：A,得到部分纠正的CK倒置患者CK同工酶电泳结果，结果显示患者除存在明显的巨CK-Ⅱ(线粒体型CK)条带；B,未得到纠正的CK倒置患者CK同工酶电泳结果，结果显示患者存在明显的巨CK-Ⅰ条带。横坐标为相对位置，峰的高度表示对应位置的吸光度大小。

3 讨论

目前试剂盒中常采用免疫抑制法检测CK-MB活性。临床实践表明，这一检测方法常能得到CK-MB活性高于总CK活性即CK结果倒置的情况[3-5]。这类患者常需通过额外的CK-MB质量法或CK同工酶电泳检测来得到可靠的结果。临床研究表明，引起CK结果倒置很大一部分的原因在于巨CK、MtCK等异常CK同工酶的存在[4-6]。因此，增加这类CK同工酶的抑制性抗体以使CK-MB活性检测更加准确至关重要。

MtCK是存在于细胞线粒体内膜、外膜间隙中的CK同工酶家族成员，其与CK-BB、CK-MM和CK-MB等一同在组织细胞能量代谢过程中扮演重要角色。MtCK可分为广泛型(ubiquitous MtCK，uMtCK)和肌节型(sarcomeric MtCK)2种不同亚型，前者广泛表达于肝脏、脑、肾脏等组织器官中，而后者仅见于横纹肌[7]。在炎症性疾病或肿瘤疾病中，由于大量的组织损伤及后续细胞凋亡过程的发生，MtCK被释放入血。目前常规试剂盒采用免疫抑制法检测的原理，添加的抑制性抗体无法抑制血液中多余的MtCK的活性，所以MtCK常能引起这类患者CK-MB活性假性增高。近年来，也有许多研究发现了MtCK与肝炎、结直肠癌、肝癌等疾病的相关性[7-10]。

本研究选择添加MtCK抑制性抗体的CK-MB检测试剂盒进行相关的性能验证及临床应用评价。在临床应用方面，添加了MtCK抑制抗体的试剂盒对临床心血管疾病的辅助诊断无明显影响。而对CK倒置患者标本的检测结果表明，运用添加了MtCK抑制抗体的试剂盒能较好地纠正由于巨CK-Ⅱ存在导致的CK结果倒置，从而能更好地为临床提供参考，其结果也得到了CK同工酶电泳的验证。由于巨CK-Ⅰ、过多的CK-BB等其他CK同工酶亚型存在而导致的CK倒置情况可能仍需CK同工酶电泳来进行确认。然而电泳方法对于临床工作来说速度较慢，操作较为不便，对操作人员的要求也较高。此外，临床对CK的来源也相当需要关注，尤其需要防止心源性CK-MB升高的误诊和漏诊。因此，需要一些更加快速简便的方法对CK结果倒置的原因进行分辨。王爱华等[11]利用多种方法对巨CK、CK及其亚型进行分辨，其中热失活方法可使CK-BB、CK-MB快速失活，适用于分辨CK-BB型的CK结果倒置，而CK-MB型可通过其他方法，如单克隆抗CK-MB抗体法直接检测。热失活法结合目前成熟的商业化CK和CK同工酶试剂，可以较快地对CK亚型进行分辨，但对于巨CK的快速分型，目前技术条件仍不成熟。