介绍一种改良的Von Kossa钙盐染色法

李 丽，陈 菲，包春娟，周琪琪，包 骥

在牙齿及骨骼外出现的钙沉积均为病理性钙盐沉积。草酸钙结晶性肾损伤的发病机制及其治疗靶点的基础研究中，实验大鼠肾组织内沉积的草酸钙结晶在HE染色中不易观察，借助Von Kossa钙盐染色法对实验动物行钙盐特殊染色，以便半定量统计各肾脏组织内草酸钙结晶的量。Von Kossa钙盐染色法是一种金属置换法，硝酸银溶液作用于含有不溶性钙盐的切片时，钙被银置换，银盐在光的作用下被还原为黑色金属银，钙盐沉积处染色为黑色。Von Kossa钙盐染色法中最关键的硝酸银溶液染色步骤需要阳光照射，传统方法是将其置于阳光下或60 W灯泡前，放置1 h或更长时间，整个染色步骤耗时长且不容易控制。36 W四灯管紫外光固化灯具有光照能量大、强度稳定、180°照射、不留死角等优点，主要用于手机主板焊盘绿油快速固化。本文现介绍一种改良的36 W紫外光固化灯加速Von Kossa钙盐染色法，与传统方法相比，其操作简单、染色快且背景干净，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料(1)样本制片：草酸钙结晶实验大鼠50只，肾脏组织离体后立即置于10%中性福尔马林固定48 h，常规石蜡包埋后行4 μm厚连续切片3张，65 ℃烤片1 h，常规脱蜡至流水冲洗后放入双蒸水中待染，1张切片常规行HE染色，剩下2张切片分别用传统方法和改良方法行Von Kossa钙盐染色法。(2)试剂：Von Kossa钙盐染色法试剂盒购自北京索莱宝公司(G3282)，苏木精染液购自Thermo公司(7211)。(3)耗材：Super PAP Pen超级免疫组化油笔购自福州迈新公司(PEN-0002)。(4)小型设备：国产36 W快速紫外光固化灯(SS-818)。(5)大型设备：全自动封片仪(Thermo，ClearVue)；WSI全数字切片扫描仪(3DHISTECH, Pannoramic SCAN)。

1.2 方法

1.2.1传统Von Kossa钙盐染色法 (1)切片放入盛装有硝酸银液的立式玻璃染缸后，置于60 W灯泡前，把箔纸放在染色缸的后面用于反射光线，放置60 min；(2)蒸馏水洗1 min；(3)硫代硫酸钠溶液处理5 min；(4)流水冲洗后常规复染苏木精；(5)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，全自动封片仪封片后行全数字切片扫描。

1.2.2改良Von Kossa钙盐染色法 (1)切片先用免疫组化油笔画圈，再滴加500 μL硝酸银溶液，放入36 W紫外线光固化灯内(图1A、B)，放置15 min；(2)蒸馏水洗1 min；(3)硫代硫酸钠溶液处理2 min；(4)流水冲洗，常规复染苏木精；(5)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，全自动封片仪封片后行全数字切片扫描。

2 结果

改良Von Kossa钙盐染色法采用滴染法，硝酸银液染色过程方便观察，钙盐沉积含量高的肾组织切片肉眼可见黑色草酸钙结晶沉积(图1C)。传统Von Kossa钙盐染色法采用浸染法，硝酸银染色过程较长，染色过程不便取出切片，肉眼或镜下观察染色情况。草酸钙结晶模型肾组织HE染色，低倍镜下肾皮质和髓质区均可见扩张的肾小管，其内无色透明的草酸钙结晶体不易直接观察；高倍镜下部分扩张的肾小管内可见无色透明的晶体结构(图2A、B)。改良Von Kossa钙盐染色法：低倍镜下可见肾皮质和髓质区黑色钙盐沉积且背景干净，细胞核为蓝色(图2C)；传统Von Kossa钙盐染色法：低倍镜下可见皮质和髓质区黑色钙盐沉积，但肾组织内可见少许浅棕色背景，细胞核为蓝色(图2D)。

图1 36 W快速固化灯内Von Kossa钙盐染色法操作：A.三台36 W紫外光固化灯同时操作，Von Kossa钙盐染色法；B.15 min硝酸银液染色结束时每张切片剩余染液量；C.钙盐沉积量高的肾组织切片肉眼可见黑色草酸钙结晶沉积

图2 大鼠草酸钙结晶模型肾组织HE染色及Von Kossa钙盐染色：A. HE染色可见肾皮质和髓质区散在扩张的肾小管，扩张的肾小管管腔大小不一；B. HE染色可见部分扩张的肾小管腔内无色透明的晶体结构；C.改良Von Kossa钙盐染色法可见肾皮质和髓质区散在黑色钙盐沉积，细胞核为蓝色；D.传统Von Kossa钙盐染色法可见肾皮质和髓质区散在黑色钙盐沉积，部分区域可见浅棕色背景，细胞核为蓝色

3 讨论

肾结石是常见的泌尿系统疾病，研究发现患者的结石成分主要以草酸钙为主[1]。在草酸钙结晶性肾损伤发病机制及其治疗靶点的基础研究中，实验大鼠肾组织内沉积的草酸钙结晶HE染色时，不易观察及统计钙盐含量，借助Von Kossa钙盐染色法低倍镜下可见清晰的黑色草酸钙结晶沉积。Von Kossa钙盐染色法制片质量直接影响染色结果统计分析的准确性。本科室日常工作中已将36 W紫外光固化灯用于Von Kossa钙盐染色法实验，其操作方便易控制，染色快效果稳定。改良Von Kossa钙盐染色法与传统Von Kossa钙盐染色法比较有以下优点。

3.1 提高工作效率丁伟等[2]发现传统Von Kossa钙盐染色法的硝酸银液需置于阳光下或60 W灯泡下，并且还需用箔纸或镜子放在染色缸的后面用于反射光线，耗时1 h或更长。本组采用36 W四灯管紫外光固化灯具有光照能量大、强度稳定、180°照射、不留死角等优点，实践证明改良后的硝酸银液染色步骤15 min即可肉眼观察肾组织上的黑色钙盐沉积。改良Von Kossa钙盐染色法由传统的耗时60 min降到15 min，缩短了45 min，显著提高工作效率。

3.2 降低成本、提高染色质量传统Von Kossa钙盐染色法采用染色缸浸染，常选用立式玻璃染缸，每缸需染色试剂50 mL，每缸一次最多放置9张切片。假设需做50张肾组织Von Kossa钙盐染色，可选择多个立式染缸同时浸染，试剂消耗多、成本高；也可选择同一缸反复浸染，但耗时长。改良Von Kossa钙盐染色法采用滴染法，每张大鼠肾组织切片滴500 μL染液量，本科室经长期实验发现在36 W四灯管紫外光固化灯内照射30 min会明显减少切片上的染液，而照射15 min染液减少量较少。假设需做50张肾组织Von Kossa钙盐染色法，需50 mL试剂。36 W四灯管紫外光固化灯价格便宜、有效期长。改良Von Kossa钙盐染色法比传统Von Kossa钙盐染色法在试剂消耗上显著降低。叶恩如等[3]报道滴染法具有染色均一、恒定，交叉污染率低的优点。李金龙等[4]也报道滴染不仅解决了标本与标本间的相互污染问题，同时保证了染色效果的均一性和稳定性。与本实验结果一致，改良Von Kossa钙盐染色法中使用的滴染法比传统浸染法染色更稳定，硝酸银染色时间短、组织切片不易产生背景，有效提高染色质量。

综上所述，改良Von Kossa钙盐染色法具有耗时少、试剂成本低等优点，且染色效果稳定，该方法操作简单快捷、节约成本，值得临床推广。