提高Grocott六胺银染色质量的几点细节

陈世梁，吴文川，胡莎莎，卢志承

真菌感染是临床上较常见的感染性疾病，部分真菌感染病灶和炎症、结核、肿瘤病灶难以鉴别，常用Grocott六胺银染色检测组织中的真菌来确诊。近年来由于环境恶化和广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂的广泛使用，以及临床上侵入性操作的普遍开展，使人体抵抗力下降，导致真菌感染性疾病日益增多[1-2]。因此，Grocott六胺银染色检测真菌的应用越来越广泛，这就需要更高质量的染色效果。为提高染色质量，本文对传统方法进行了改良，在实践工作中取得了比较满意的效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取海南省人民医院送检真菌感染的活检标本29例,其中肺15例，鼻部4例，扁桃体3例，淋巴结3例，足2例，肝1例，角膜1例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规取材、脱水、透明、浸蜡、包埋。

1.2 主要仪器GZX-GF-MBS电热恒温鼓风干燥箱，购自上海跃进医疗器械公司；LEICA CM2245切片机，购自德国徕卡公司；樱花VIP-6脱水机，购自日本。

1.3 试剂及配制(1)六胺银原液：将5%硝酸银5 mL加入到3%六次甲基四胺100 mL内，即形成白色沉淀，慢慢摇动至沉淀溶解变清，用棕色瓶装，4 ℃保存[3]。(2)传统六胺银工作液：六胺银原液25 mL，蒸馏水25 mL，5%四硼酸钠2 mL，依次加入，混合后即可使用。(3)改良六胺银工作液：六胺银原液10 mL，蒸馏水25 mL，5%四硼酸钠2 mL，依次加入，混合后即可使用。(4)5%铬酸水溶液：铬酸5 g，蒸馏水100 mL。(5)8%铬酸水溶液：铬酸8 g，蒸馏水100 mL。(6)0.5%偏重亚硫酸钠水溶液：偏重亚硫酸钠0.5 g，蒸馏水100 mL。(7)0.2%氯化金水溶液：氯化金0.2 g，蒸馏水100 mL。(8)0.1%氯化金水溶液：氯化金0.1 g，蒸馏水100 mL。(9)5%硫代硫酸钠：硫代硫酸钠5 g，蒸馏水100 mL。(10)橙黄G液：橙黄G 2 g，磷钨酸5 g，蒸馏水100 mL。

1.4 方法29例蜡块每例分别4 μm厚切片2张，分成传统组和改良组，分别按各自的染色方法进行染色。

1.4.1传统Grocott六胺银染色法 (1)切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗；(2)5%铬酸溶液氧化1 h，流水冲洗，再用蒸馏水洗2次；(3)5%偏重亚硫酸钠水溶液处理1 min；(4)流水冲洗5 min，再用蒸馏水浸洗2次；(5)置入传统六胺银工作液1～1.5 h(于45～50 ℃温箱内)，至切片呈黄褐色，镜下观察真菌呈黑褐色为止；(6)蒸馏水浸洗3次；(7)滴入0.2%氯化金溶液调色3 min，蒸馏稍洗；(8)5%硫代硫酸钠处理2 min；(9)流水冲洗5 min；(10)橙黄G液复染30 s，流水稍洗；(11)常规脱水透明，中性树胶封固[4]。

1.4.2改良Grocott六胺银染色法 本实验主要对以下3个关键步骤进行改良：第(2)步改为8%铬酸溶液氧化20 min；第(5)步改为切片置入预热至60 ℃的改良六胺银工作液内，于60 ℃温箱内作用20～60 min，至切片呈淡黄色，镜下观察真菌呈黑褐色为止；第(7)步改为滴入0.1%氯化金溶液调色1 min(显微镜下观察)。其余染色步骤同传统染色法。

2 结果

29例标本经两种方法染色的真菌检出率均为100%，但改良染色法染色效果优于传统法。改良染色法真菌呈棕黑至黑色，菌体和背景着色适度，对比明显而清晰(图1)；传统染色法真菌呈棕黑至黑色，背景欠清，菌体与组织混杂(图2)。

图1 肺组织中隐球菌呈棕黑至黑色，菌体与背景着色对比清晰，改良Grocott六胺银染色法 图2 肺组织中隐球菌呈棕黑至黑色，背景欠清，菌体与组织混杂，传统Grocott六胺银染色法

3 讨论

在患者活检组织中找到真菌是诊断真菌感染的金标准，而常规HE染色中大部分真菌着色不佳，易漏诊，需用特殊染色法显示，最常用的是Grocott六胺银染色[5-6]。传统Grocott六胺银染色存在染色时间过长、易过染、背景不清晰等缺点，为提高染色效果，本科室作了一些改良。

3.1 加强氧化Grocott六胺银染色的机制是各种真菌菌壁都含有多糖类物质，铬酸氧化真菌内多糖化合物而暴露出醛基，游离的醛基还原六胺银的银离子成黑色的金属银而显色。要在组织切片上清晰显示真菌，必须做到氧化充分，传统法是5%铬酸氧化1 h，改良法用8%铬酸氧化20 min即可，一方面缩短了染色时间，同时也避免氧化时间过长造成的组织结构破坏；另一方面8%铬酸有更强的氧化能力，暴露出更多的醛基，增强了染色的敏感性。

3.2 适当降低六胺银工作液银浓度传统法六胺银工作液中银的含量较高，真菌着色太快，不易操作，如果温度过高或染色时间过长都会过染，一旦过染经水洗和氯化金调色，也难以将组织切片上非特异性着色清洗干净，影响染色效果。传统法工作液的配制是六胺银原液25 mL，蒸馏水25 mL，5%四硼酸钠溶液2 mL；而改良法是六胺银原液10 mL，蒸馏水25 mL，5%四硼酸钠溶液2 mL，通过降低原液的量而降低了改良六胺银工作液中银的含量，真菌着色反应比较温和，容易控制温度和染色时间。

3.3 控制染色的温度和时间温度在六胺银染色中至关重要，温度在60 ℃以下，组织反应缓慢，浸染时间长，温度如果更低，则几乎不反应；温度过高，组织反应快，易过染，难以控制。六胺银染色时间的长短受染液的银浓度和染色温度影响，染色时间过短，染色反应不足，真菌着色浅，不能清晰显示出来；染色时间过长，染色反应过度，真菌着色很深，易出现银镜反应，切片背景较脏，影响对比度。本科室使用的改良方法是预先打开烤箱将温度设置为60 ℃，滴上8%铬酸开始氧化后即配制工作液，放入烤箱中预热，等操作到浸染步骤时温度也达到60 ℃，不仅保证工作液质量，又有效地缩短了反应时间。浸染20 min后仔细观察切片，染成淡黄色即取出，经蒸馏水洗后，在显微镜下观察是否有菌体出现，如有淡棕色菌体出现，每隔5 min取出镜检以控制菌体着色深浅，直至认为显色恰当为止。

3.4 灵活掌握氯化金液调色程度组织经六胺银工作液浸染后，经氯化金作用可排除组织中的黄色色调，使多余的银与氯作用产生氯化银，然后再用硫代硫酸钠溶液洗去组织上未还原的银盐，从而使组织内各种成分显示得更为清晰，已反应的银盐被固定得更加牢固[7]。传统法使用0.2%氯化金调色3 min，在实践中我们发现使用此调色方法容易使着色的真菌颜色变浅呈灰色，影响观察。改良法用0.1%氯化金调色1 min，在显微镜下观察，多余的黑色沉淀变浅色至消失，蒸馏水稍洗。通过降低氯化金浓度和显微镜观察，能更好把控调色程度，真菌显示清晰，背景干净。

3.5 其他提高Grocott六胺银染色质量，还需注意以下细节：(1)切片脱蜡要彻底，否则影响铬酸有效氧化，妨碍染色。(2)玻璃器皿，应预先用硫酸洗液浸泡过并冲洗干净，以避免留有的杂质与银发生化学反应，造成染液混浊现象。(3)试剂均为分析纯，因为试剂纯度越高染色结果越敏感。(4)六胺银工作液要现配、现用，一般只用1次。(5)严格控制染色时间，银浸染步骤随时观察染色进度，及时终止染色。