Notch1/Hes1信号通路在调控低分化胃腺癌细胞钙离子和侵袭能力中的作用

张竞文，黄菱燕，秦 憬，吕怀盛，景 丽

胃癌是人类常见的恶性肿瘤，其预后与肿瘤分化程度、转移等密切相关。低分化胃腺癌与高分化胃腺癌相比，侵袭性更强、预后更差[1-4]。近年研究提示，细胞内钙离子水平影响细胞周期、能量摄取，并且参与调节癌细胞的增殖、浸润、转移等[3,5]。钙依赖性钙蛋白酶家族(Calpain)是调控细胞钙离子的重要成分，该家族包括Calpain-1与Calpain-2[3,6]。研究显示，Calpain-1高表达可促进口腔鳞状细胞癌浸润和转移[6]。Hes1基因是Notch1信号通路的靶基因，在维持细胞的未分化状态、分化方向中发挥重要作用[1,4,7]。已有研究显示，Notch1信号通路参与胃癌细胞增殖能力的调节[1]；Hes1在胃癌浸润和转移过程中发挥作用，胃癌组织浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期均与Hes1高表达相关[1-2]；在进展期胃癌以及侵袭能力强的胃癌细胞系也有比较高的Hes1表达[7]。目前，Hes1基因参与胃癌进展的分子机制尚不清楚，Notch1/Hes1对胃癌细胞钙离子的影响有待于进一步分析。本文采用免疫组化、基因沉默、Transwell、Flou-4、Western blot法检测低分化胃腺癌、MGC-803胃癌细胞中Notch1/Hes1蛋白表达及其对钙离子水平的影响，探讨Notch1/Hes1对胃癌细胞钙离子水平及侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料收集2016～2018年宁夏医科大学总医院收治的低分化胃腺癌及癌旁正常组织各32例。MGC-803人低分化胃癌细胞株购自北京北纳生物公司。实验所用试剂购自北京中杉金桥公司和武汉博士德公司，主要包括Notch1、Hes1、Calpain-1(Abcam 公司)，vimentin、E-cadherin、β-actin兔多克隆抗体(Proteintech 公司)，RPMI 1640培养基、青链霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(HyClone公司)，Flou-4 AM钙离子检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)，总蛋白提取试剂盒(索莱宝公司)，Transwell小室(Corning公司)，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen公司)，ECL超敏发光液(Thermo Fisher Scientific公司)，Matrigel基质胶(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1分组 32例低分化胃腺癌为胃癌组，32例癌旁正常组织为对照组。标本均经10%中性福尔马林固定，常规取材，石蜡包埋、切片。MGC-803人低分化胃癌细胞株分为对照组、Lipofectamine 2000组、Notch1 siRNA组、Hes1 siRNA组。

1.2.2免疫组化 采用免疫组化SP法进行染色，主要步骤如下：(1)切片经脱蜡，水化；(2)柠檬酸缓冲液微波抗原修复；(3)一抗4 ℃孵育过夜，Notch1(1 ∶200)、Hes1(1 ∶500)、Calpain-1(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶200)；(4)二抗37 ℃孵育1 h，DAB显色；(5)苏木精复染，脱水，透明，封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，光镜观察，≥10%的癌细胞阳性着色为阳性。

1.2.3Notch1 siRNA和Hes1 siRNA转染 本组参考Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作，主要步骤如下：(1)无血清培养24 h，Lipofectamine 2000与对应siRNA预混配置成工作液，工作浓度为100 nmol/L，室温孵育25 min；(2)取对数增殖期的MGC-803细胞，按每孔8×105个细胞平铺在6孔板中，稳定培养24 h；(3)待生长融合度约50%时，更换siRNA预混工作液，继续孵育24 h；(4)更换含血清培养基工作液，继续培养24 h；(5)收集和检测各组中Notch1、Hes1的蛋白表达。Notch1 siRNA正向引物5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′，反向引物5′-AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG-3′；Hes1 siRNA正向引物5′-GAAUUUGGGAGCUGUUUAUTG-3′，反向引物5′-AUAAACAGCUCCCAAAUUCTG-3′。

1.2.4Flou-4 AM检测 取对数增长期细胞，接种于6孔板中(5×105个/孔)，37 ℃、48 h。加入1 mL培养基工作液和1 mL Flou-4 AM染色工作液，37 ℃、20 min。吸除上清，Flou-4 AM染色缓冲液(1×)洗涤2次，加入2 mL细胞培养液。荧光显微镜下观察拍照，IPP 6.0软件进行结果分析。

1.2.5Transwell实验 Matrigel预包被Transwell小室；将细胞接种于Matrigel预包被Transwell小室的上室(5×105个/室)，加无血清培养液，下室加含血清液培养，37 ℃、48 h。标本经4%多聚甲醛固定10 min，棉签拭去上层未转移的细胞，下层结晶紫染色并细胞计数。

1.2.6Western blot检测 取对数生长期的MGC-803低分化胃癌细胞，各组细胞经预处理后，应用全蛋白提取试剂盒提取蛋白。提取前30 min配裂解液，4 ℃放置5 min，剧烈震荡30 s，合计5个循环，离心去除细胞碎片及杂质，分装蛋白。应用蛋白含量检测试剂盒测OD值，100 ℃、10 min，上样。1×SDS蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜，用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h。一抗Notch1(1 ∶1 000)、Hes1(1 ∶1 000)、Calpain-1(1 ∶500)、vimentin(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、和β-actin(1 ∶3 000)4 ℃孵育过夜。二抗(1 ∶3 000)37 ℃孵育1 h。采用ECL化学发光显影剂显影并曝光保存。应用Image J软件测量条带灰度值，以β-actin作为内参，以两者灰度值的比值表示相对蛋白表达量。

2 结果

2.1 临床特点32例低分化胃腺癌中男性23例，女性9例，年龄36～77岁，中位年龄56岁。其中黏膜下层以内的早期胃癌3例(9.38%)，中晚期胃癌29例(90.62%)。32例均符合低分化腺癌的组织学特征，癌细胞形成条索状(图1A)、团块状、小片状癌巢，可见不规则腺管样结构，浸润性生长。癌旁黏膜组织主要为幽门腺(图1B)和胃体腺，可见肠上皮化生及不典型增生。免疫组化结果显示，本组32例均表达腺癌的阳性指标CK20(图1C)，Ki-67增殖指数为26.64%±6.83%(图1D)，证实为低分化胃腺癌。

2.2 免疫表型本组癌旁正常腺体可见少数细胞出现Notch1、Hes1表达，低分化胃腺癌组织中Notch1、Hes1表达明显增多，主要表达于细胞质，少数细胞为细胞核表达。在癌旁正常腺体可见少数细胞有Calpain-1蛋白表达，主要表达于细胞膜，低分化胃腺癌组织中Calpain-1蛋白强表达，定位于细胞质和细胞核。癌旁组织中E-cadherin弥漫表达，低分化胃腺癌组织中E-cadherin偶见阳性细胞。经χ2检验，Notch1、Hes1、Calpain-1、E-cadherin蛋白在低分化胃腺癌组织(阳性率分别为93.75%、96.88%、96.88%和25.0%)与癌旁组织(阳性率分别为21.88%、18.75%、25.0%和93.75%)的表达差异有显著性(P<0.05)，低分化胃腺癌组织中Hes1、Notch1、Calpain-1表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，E-cadherin表达明显低于癌旁正常组织(P<0.05，图2)。

2.3 Notch1和Hes1 siRNA检测将Notch1 siRNA和Hes1 siRNA干扰序列转染MGC-803细胞，培养48 h后，Western blot检测细胞中Notch1和Hes1的蛋白表达(图3A)，结果显示Notch1和Hes1的蛋白表达明显降低(图3B)，提示干扰成功。

图1 A.胃低分化腺癌，癌细胞排列呈条索状； B.癌旁正常黏膜组织，为幽门腺；C.胃低分化腺癌中CK20呈阳性，SP法；D.胃低分化腺癌中Ki-67呈阳性，SP法

2.4 Transwell检测培养48 h 后，在对照组和Lipofectamine 2000组均可见多量癌细胞迁移(图4A、B)，而Notch1 siRNA组和Hes1 siRNA组癌细胞迁移明显减少(图4C、D)；对照组、Lipofectamine 2000组[每视野分别为(340±46)个细胞和(348±63)个细胞]与Notch1 siRNA组和Hes1 siRNA组迁移细胞数量[每视野分别为(95±22)个细胞和(63±26)个细胞]差异有统计学意义(P<0.05)，Notch1 siRNA和Hes1 siRNA转染均可显著减少MGC-803胃癌细胞的迁移。

2.5 胃癌细胞钙离子水平检测本组经Flou-4检测不同分组MGC-803细胞钙离子水平结果显示，在对照组和Lipofectamine 2000组，癌细胞钙离子分别为0.39和0.38(图5A、B)；与对照组和Lipofectamine 2000组比较，Notch1 siRNA组(0.11)和Hes1 siRNA组(0.14)胃癌细胞钙离子水平明显降低(P<0.05，图5C、D)；而Notch1 siRNA与Hes1 siRNA两组间癌细胞的钙离子水平，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 Western blot检测本组Western blot结果显示，在对照组、Lipofectamine 2000组、Notch1 siRNA组和Hes1 siRNA组均可见Calpain-1、vimentin、E-cadherin蛋白表达(图6A)；与对照组和Lipofectamine 2000组比较，Notch1 siRNA组和Hes1 siRNA组Calpain-1、vimentin的表达均降低，而E-cadherin表达明显增加；经蛋白相对表达量分析，Notch1 siRNA和Hes1 siRNA转染可降低vimentin和Calpain-1、E-cadherin的表达(P<0.05)，增加E-cadherin的表达(P>0.05，图6B)。Notch1 siRNA与Hes1 siRNA两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

胃癌是病死率较高的恶性肿瘤之一，其侵袭能力和转移是影响患者生存的主要因素[1,5]。已有研究提示，有多种因素能够影响癌细胞的增殖以及浸润[4,8]。本组32例低分化胃腺癌组织中Notch1、Hes1、Calpain-1表达明显增多，E-cadherin表达明显低于癌旁组织；与以往报道基本一致[2,4]，Notch1和Hes1蛋白高表达参与低分化腺癌的侵袭能力调控[2,4-5]。本组低分化胃腺癌组织Calpain-1表达明显高于癌旁组织，与口腔鳞状细胞癌研究结果基本一致[6]，提示低分化胃腺癌涉及钙离子水平的异常变化[3,6]。

图2 癌旁组织和胃癌组织中蛋白免疫组化染色：癌旁组织中少数细胞Notch1、Hes1和Calpain-1蛋白呈阳性，E-cadherin呈弥漫阳性，SP法；胃癌组织中癌细胞Notch1、Hes1和Calpain-1蛋白均呈弥漫阳性，癌细胞偶见E-cadherin呈阳性，SP法

图3 Notch1 siRNA和Hes1 siRNA干扰效果：A.Western blot检测Hes1、Notch1蛋白表达；B.相对灰度值统计分析；与对照组、Lipofectamine 2000组比较，*P<0.05

图4 Transwell检测细胞迁移：A.对照组，癌细胞密集； B.Lipofectamine 2000组，癌细胞丰富；C.Notch1 siRNA组，癌细胞减少；D.Hes1 siRNA组，癌细胞减少

图5 Flou-4检测细胞钙离子水平：A.对照组，钙离子信号增强； B.Lipofectamine 2000组，钙离子信号弥漫增强；C.Notch1 siRNA组，钙离子信号减少；D.Hes1 siRNA组，钙离子信号减少

图6 Western blot检测：A.Western blot检测vimentin、E-cadherin、Calpain-1蛋白表达；B.相对灰度值统计分析；与对照组和Lipofectamine 2000组比较，*P<0.05

已有研究证明，在胃癌发生、发展过程中，可有多种基因发挥调节作用[1,3,8]。Hes1属于DNA结合蛋白，受Notch1信号调节，Notch1/Hes1信号调节通路在组织分化过程中发挥重要作用[1,7,9]。本组结果显示，在MGC-803胃癌细胞进行Notch1 siRNA和Hes1 siRNA转染后，Notch1和Hes1蛋白表达明显降低，并可显著减少癌细胞的迁移，再次提示Notch1/Hes1信号调节蛋白在胃癌细胞侵袭过程中发挥重要作用[1,2,4]。有研究提示，抑制Notch1/Hes1信号通路可显著降低裸鼠结肠癌移植瘤的生长[10]。在人胃腺癌组织和小鼠胃种植瘤模型中可见，Notch1/Hes1和mTORC1信号通路显著增强，促进胃癌细胞增殖[1]。体外研究提示，通过抑制Notch1/Hes1信号通路可减少癌细胞集落形成，降低胃癌细胞的侵袭能力[11]。

Calpain包括Calpain-1与Calpain-2，是调控细胞钙离子的重要成分[6]。有文献报道在癌细胞增殖、转移过程中，均涉及钙离子和钙离子相关蛋白的作用[12-13]。本组结果显示，低分化胃腺癌组织和MGC-803胃癌细胞中Calpain-1表达明显增多，Notch1和Hes1基因沉默后，MGC-803胃癌细胞钙离子水平以及其迁移能降低，并伴Calpain-1表达降低；提示高表达Calpain-1可能与癌细胞钙离子水平升高及其迁移能力增加有关[12-13]。关于Notch1/Hes1信号通路在Calpain-1调控细胞钙离子过程中的作用尚不清楚。Squecco等[12]报道细胞钙离子水平与Notch1表达相互作用，参与调节乳腺癌MCF-7细胞的增殖和侵袭。Calpain-1高表达可增加癌细胞侵袭能力和耐药性，抑制Calpain-1表达可促进癌细胞凋亡，逆转顺铂耐药性[14]。Ren等[6]报道口腔鳞状细胞癌中高表达的Calpain-1能够促进癌细胞浸润和转移。本组前期研究显示胃癌发生过程中可出现Hes1高表达，并与C-myc和p53基因变化及CEA表达相关[4]。本组结果显示，胃癌细胞侵袭能力与Notch1/Hes1蛋白高表达有关，同时伴Calpain-1高表达及细胞钙离子水平升高；反之亦然，提示Notch1/Hes1信号通路参与Calpain-1相关的MGC-803细胞钙离子水平调节[8,12,14]。

本实验结果可见，低分化胃腺癌组织E-cadherin表达明显降低，MGC-803细胞Notch1和Hes1基因沉默也可显著降低vimentin和提高E-cadherin的表达；提示Notch1/Hes1信号通路还可通过细胞黏附、上皮-间质转化参与胃癌细胞侵袭能力的调控[2,15]。Notch1/Hes1信号通路可能与细胞内钙离子调控机制存在串扰关系，其最终作用可能涉及复杂的细胞信号网络[1,3,15]。本实验仅在单一类型的胃癌及其细胞株进行相关观察，关于Notch1/Hes1蛋白参与细胞钙离子水平调节的作用及其机制，尚需更深入的研究。