MALDI-TOF MS技术在粮油与食品微生物快速鉴定领域的应用
2021-03-31展望韩庄绪会邹海杰陈红娟苗海江罗晓宏谢嫣琪
展望韩 伟 庄绪会 邹海杰 孙 博 陈红娟 苗海江 罗晓宏 谢嫣琪
(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术,是20世纪后期发展起来的一种新型“软电离”质谱技术,广泛用在临床诊断、环境监测及食品检测等多领域。MALDI-TOF MS是基质辅助激光解吸离子源和飞行时间质谱的串联体，它不产生或者产生很少的碎片离子，使不挥发性与热不稳定性的生物大分子和高分子聚合物的检测成为可能[1，2]；这主要得益于MALDI的特点，即准分子离子峰很强，几乎无碎片离子，因此可直接分析蛋白质酶解后产生的多肽混合物[3]。在MALDI-TOF MS的诸多应用中，微生物快速检测即是基于微生物表面蛋白分子量检测而实现的[4，5]。
在粮食及油料种子的收获、储存、运输、销售及其食品加工过程中，微生物是无处不在的，主要包括的微生物类群：细菌类中的真细菌和放线菌，真菌类中的霉菌、酵母菌和病原真菌等[6，7]。有研究以小麦和玉米为研究对象，分析测定粮食储藏前以及储藏过程中微生物多样性，发现在小麦内部单端孢霉(Trichodermamonocytogenes)，灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、节菱孢霉(Arthrosporium)均有检出，小麦外部分布着单端孢霉属(Trichothecium)，镰刀霉属(Fusarium)，木霉属(Trichoderma)，头孢霉属(Cephalosporium)，交链孢霉属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)；同时，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等细菌也被培养法检出[8]。张秀宇等[9]汇总了全国2016—2019年粮食加工品国家食品安全监督抽检结果，对不合格项目信息进行分类统计分析，发现不合格项次中微生物原因占比32.86%，真菌毒素占比20.31%。因此，粮油及其食品样品中所涵盖微生物的复杂且多样，必然要求准确性高、鉴定速度快、能实现高通量的鉴定技术储备。
本文综述了MALDI-TOF MS技术在微生物鉴定原理、鉴定细菌与真菌的应用实践以及影响因素等方面的最新研究进展，详细阐述MALDI-TOF MS技术的优越性同时，展望了它在粮油与食品微生物鉴定中的应用潜力。
1 MALDI-TOF MS技术的原理
MALDI-TOF MS技术的基本原理是：MS用来检测m/z(质荷比)，MALDI是软电离技术，基质从紫外线激光吸收能量，以最小的碎片从大分子中产生离子，而TOF是质量分析器，m/z比可以由离子的飞行时间来确定，随后计算出离子质量[2]。
对于微生物鉴定来说，经过样品准备、质谱分析、数据库比对等步骤最终得到鉴定结果。α-氰基-4-羟基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)常用于MALDI样品的制备中。m/z为2 000～20 000的多肽或蛋白质常被用于分析。不同微生物核蛋白的序列和长度等都不同且高度保守，因此，纯菌株的一系列质谱峰亦有其独特性[10-12]。故以蛋白质为靶标分子，微生物的质量图谱与已知质谱图数据库中的特征性质谱图比对，筛选并确定出特异性图谱，达到对目标微生物的检测。在商业化软件中，未知微生物图谱与数据库中标准指纹图谱进行比较，可以鉴定到细菌的属、种、甚至亚种[13]。鉴定依据主要有几点：微生物的特异性指纹图谱之间的差异性；特征性生物分子提供的模式峰，用于属、种、株系鉴定；高通量微生物鉴定系统可自动化分析特异性指纹图谱；样品的指纹图谱与数据库中的标准指纹图谱进行匹配，依照分值对鉴定结果进行分级和归类[14]。
2 MALDI-TOF MS技术在微生物鉴定中的影响因素
2.1 MALDI-TOF MS技术与其他鉴定技术比较
微生物鉴定通常包含形态水平、生化水平、基因水平和蛋白水平，常用方法如菌形与菌落分析、生理生化试验、脂肪酸分析、拉曼光谱法、保守基因检测、基因杂交及MALDI-TOF MS方法等[15-17]。在现行的国家标准中，粮油与食品微生物多以形态学、生理生化反应或/和保守基因为基础进行鉴定。
龚艳清[18]等对比MALDI-TOF MS与传统的生化鉴定方法和聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定不同株李斯特菌的结果，验证了MALDI-TOF MS方法的准确性和可重复性。李慧等[19]结合形态学观察、16S rRNA基因分析及MALDI-TOF MS等三种技术分离并鉴定微生物，研究了土豆烧牛肉方便菜肴产品的胀袋问题。Marta等[20]对比了16S rDNA限制性酶切片段多样性和MALDI-TOF MS方法、对80株乳杆菌完成鉴定，并认为两种方法都是有效的鉴定工具。Kazuyuk等[21]同样对比了16S rRNA基因分析与MALDI-TOF MS方法，MALDI-TOF MS鉴定到种和属的准确率分别为91.7%(429/468)和97.0%(454/468)。以上结果表明，与传统鉴定方法比较，基于蛋白水平检测的MALDI-TOF MS方法同样具有很高的准确率和复现性。
2.2 基于MALDI-TOF MS技术的设备比较
目前，市场上可选择的、成熟的MALDI-TOF MS鉴定系统不多，不同质谱系统得到的鉴定结果也不尽相同。Li等[22]对比VITEK MS和MALDI biotyper system鉴定，准确率分别为90%和86%。李艳君等[23]对比MALDI-TOF MS、VITEK MS微生物鉴定系统和显色培养法，鉴定206株酵母菌，准确率分别是：VITEK MS鉴定仪为82.5%，显色培养法为67.0%，MALDI-TOF MS 为92.7%。王伟[24]使用VITEK MS和 MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS对比分析40株标准菌株和18 株阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)野生菌株，两者特征峰的出峰位置和相对峰强度无明显差异。
2.3 其他因素
在MALDI-TOF MS鉴定过程中，除设备类型外，微生物的培养基及培养条件、样品处理方式、试剂及浓度、靶点涂布均匀性、菌种特异峰及峰值数量等因素也是影响鉴定结果的重要原因。
不同培养基(哥伦比亚血琼脂、沙氏琼脂和念珠菌显色琼脂)和甲酸浓度(60%～90%)对MALDI-TOF MS鉴定白假丝酵母菌(Candidaalbicans)结果有不同程度的影响；在血琼脂培养基和沙氏琼脂培养基中的白假丝酵母菌、用90%浓度的甲酸处理的结果无差异[25]。李凤琴等[26]研究了培养基成分(查氏酵母提取粉琼脂培养基
3 MALDI-TOF MS技术在微生物鉴定中的应用现状
3.1 MALDI-TOF MS技术在细菌鉴定方面的应用
Anhalt等[27]提出了利用质谱法分析蛋白，进行细菌鉴定的概念。至今，相关研究内容已涉及细菌鉴定、细菌分型、抗生素抗性分析及代谢产物。MALDI-TOF MS已成功应用于食品微生物、临床微生物、养殖病原菌等多个应用领域。在粮油微生物方面，目前细菌检测没有足够的重视和要求。MALDI-TOF MS鉴定在其他领域的应用，对于未来粮油微生物检测，将有很好的借鉴意义。
3.1.1 食品微生物鉴定
范铁男等[28]以19株已知标准菌株建库，鉴定分离自人体粪便、泡菜、乳制品等样品中60株待检菌株，均能正确地鉴定到属水平，87.7%的菌株鉴定到种水平。杨祖顺等[29]取自不同类食品来源的、共210株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，采用MALDI-TOF MS对其进行鉴定，98.10%的菌株鉴定到种水平。Lucas等[30]利用MALDI-TOF MS成功得到大豆中根瘤菌(Bradyrhizobium)的指纹谱图。
3.1.2 临床微生物鉴定
Li等[22]通过meta分析研究了覆盖6685株厌氧菌的质谱法鉴定，得到结论如下：84%的菌鉴定到种(I2= 98.0%，P<0.1)，92%的菌鉴定到属(I2=96.6%，P<0.1)，准确率由高到低分别为：拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、副拟杆菌(Parabacteroides)、梭菌(Clostridium)等，然而，稀有厌氧菌的准确率偏低。李进等[31]利用MALDI-TOF MS检测258株金属酶铜绿假单胞菌(metallo-β-lactamasePseudomonasaeruginosa)，识别VIM型菌株的灵敏度为92.0%、特异性为100.0%，阳性预测值为100.0%，而SPM型菌株的灵敏度为80.0%，特异性为100.0%，阳性预测值均为100.0%。沈佳瑾等[32]收集32株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和28株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，利用MALDI-TOF MS均能快速鉴别耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae)。吴思颖等[33]利用MALDI-TOF MS快速鉴定新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隐球菌(C.gattii)，并能够区分新生隐球菌和格特隐球菌的不同基因型。
3.1.3 养殖过程中微生物鉴定
徐淑菲等[34]用MALDI-TOF MS检测进口甲鱼卵中携带病原菌，能够分离并鉴定出绿脓杆菌(P.aeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、肺炎克雷伯氏菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、沙门氏菌(Salmonella)等242株致病菌。李楠等[35]分析猪场中分离自空气的微生物并鉴定，包括芽孢杆菌、微球菌、短杆菌、葡萄球菌在内的210株菌，91%被准确鉴定到种水平，95.7%被准确鉴定到属水平。Barcelos等[36]从牛中分离186株可能与乳腺炎相关的细菌，对比了两种提取方法并使用MALDI-TOF MS鉴定。
3.2 MALDI-TOF MS技术在真菌鉴定方面的应用
在粮油与食品领域，真菌及其毒素污染始终是关乎食品安全的重点。相对于多数细菌，真菌对水活度的要求相对低，易在粮油与食品中生长；但真菌的准确、快速鉴定却要比细菌复杂得多。
3.2.1 酵母菌鉴定
MALDI-TOF MS在真菌领域最早应用于鉴定酵母菌，并在常见酵母菌鉴定中有着很高的稳定性和准确性[5]。Elsa等[37]鉴定了8株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均准确地鉴定到种水平。杨丹等[38]评估了真菌显色培养基及培养时间对假丝酵母菌在MALDI-TOF MS鉴定结果中的影响。杨静等[39]评价外阴阴道假丝酵母菌的鉴定精确性，包括白假丝酵母、非洲假丝酵母(C.africans)、都柏林假丝酵母(C.dublin)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、阿萨希丝孢酵母(Trichosporonasahii)等在内的314株，正确率为96.91%。张博筠等[40]的结果显示质谱鉴定酵母菌准确率为97.7%，而API ID 32C系统鉴定准确率为93.0%，有显著差异(χ2=9.439，P=0.002)；MALDI-TOF MS与ITS测序相比并无统计学差异。
3.2.2 丝状真菌鉴定
相比酵母菌，丝状真菌的鉴定显然更为复杂，无论传统方法还是基因测序，对实验人员知识和技能、时间和成本等都有更高要求，但MALDI-TOF MS鉴定很大程度规避了前者的缺点，同时达到很高的准确率。张伟铮等[41]对临床分离的254株丝状真菌完成鉴定，MALDI-TOF MS的总体准确率为 86.36%，对毛癣菌属(Trichophyton)、毛孢子菌属、毛霉菌属、曲霉菌属准确率很高，但对犬小孢子菌(Microsporumcaninum)、镰刀菌属、新月弯孢霉(Curvularialunata)准确率较低。张桂等[42]采用直接涂靶法(质谱直涂法)快速鉴定133株丝状真菌，质谱直涂法与另外两种方法(基因序列分析与形态学鉴定)的种、复合群和属的差异无统计学意义(χ2值分别为0.611、0.625、2.728和0.516、0.915、1.206，P>0.05)。吴友伟等[43]以102株丝状真菌为供试样品，采用Kappa值方法对质谱鉴定与形态学方法鉴定结果进行统计分析，认为MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定正确性与时效性优于形态学方法。王庆玲[44]发现67株丝状真菌MALDI-TOF MS的鉴定结果，与形态学鉴定和分子生物学鉴定结果基本一致，在属、种水平鉴定的总一致率分别为98.5%与94.1%，其中，曲霉菌—属鉴定种水平的一致率达到100%。
4 结论与展望
MALDI-TOF MS技术是微生物快速鉴定的有效方法之一。MALDI-TOF MS技术与其他鉴定方法相比，原理不尽相同、各有所长，但具有快速、简便、准确的优点。目前，MALDI-TOF MS技术亦有其使用极限，比如它还不能区分志贺氏菌和埃希氏大肠杆菌、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)和 支气管败血鲍特菌(B.branchiseptica)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)和鲁兰无色杆菌(A.ruhlandii)、诺迪拟杆菌(B.nordii)和沙雷伯氏杆菌(B.salyersiae)、6种亲缘关系近的肠杆菌(Enterobacterasburiae,E.cloacae,E.hormaechei,E.kobei,E.ludwigii,andE.nimipressuralis)、不同血清型的沙门氏菌、及蜡样芽胞杆菌(B.cereus)与苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)和蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)[2，29]。正是由于微生物间相似的遗传背景或蛋白表达差异不大等原因，质谱信号并不能清晰分辨菌种间差异；加之仪器昂贵、真菌数据库参考菌株少，故MALDI-TOF MS技术目前还不可能完全替代传统的微生物鉴定技术，但它是微生物鉴定中较好的补充方法。
MALDI-TOF MS技术在粮油与食品微生物快速鉴定中有广阔的应用空间。成熟的微生物鉴定手段和先进的鉴定设备已经在各粮油检验机构或科研机构普遍使用，但粮油与食品微生物的快速、准确鉴定方面仍存不足之处。这其中有技术本身的原因，比如16S rRNA基因测序(全步骤)、Biolog微生物鉴定系统和MIDI全脂肪酸鉴定系统的实际平均用时分别在24、24及2h/样品，而MALDI-TOF MS平均用时10～20 min/样品。同时，粮油微生物中丝状真菌多，区分产毒菌株和非产毒菌株是快速鉴定的重点，依赖蛋白分析的MALDI-TOF MS技术可能成为有效的解决手段之一。
MALDI-TOF MS技术作为近些年已广泛用于微生物鉴定的新技术，具有高通量、成本低、精确性高的特点，其结果的可靠性和精密度已被大量的研究所证明。未来，通过不断地开发针对粮油与食品样品的检测方法并逐步完善菌株质谱数据库，MALDI-TOF MS技术在粮油与食品微生物的快速鉴定领域必然有更为广阔的应用空间。
