紫玉米秸秆青贮饲料对热应激奶山羊能量利用、血浆代谢和抗氧化参数的影响

2021-09-26田亚原张旭林覃继肖王PaengkoumPramote田兴舟

中国粮油学报 2021年8期

田亚原覃谭张旭林覃继肖王旭卢琦,2 Paengkoum Pramote 田兴舟,2

(贵州大学动物科学学院1，贵阳 550025)(贵州大学动物营养与饲料研究所2，贵阳 550025)(泰国苏兰拉里理工大学3，呵叻 30000)

热应激是高温高湿环境山羊产生热量蓄积体内，增强机体热负荷引起的一系列非特异性生理反应，是阻碍奶山羊产业发展的重要因素之一。如何有效地缓解反刍动物热应激，提高生产性能，是现今亟需待解决的问题。花青素具有极强的抗氧化活性，可与不稳定自由基(free radical, FR)发生反应，抑制链式反应。同时，花青素具无残留、无污染、来源广等优点，且有抗氧化、抗炎症等生理功能，对促进家畜生长、提高机体免疫力和抗氧化能力有积极作用[1]。Tian等[2]发现，奶山羊饲喂富含花青素紫玉米秸秆青贮饲料(purple corn stover silage，PSS)可显著提高血浆超氧化物歧化酶(SOD)。周迪等[3]指出，花青素作为优良的天然抗氧化剂源，有提高反刍动物抗氧化能力、降低氧化应激的作用。Matsuba等[4]饲予泌乳期奶牛紫玉米青贮饲料，对产奶量和奶成分无显著影响，但可增强机体抗氧化性能。因此，植物源花青素饲料有提高反刍动物免疫性能和抗氧化能力的作用，有缓解机体热应激的潜力。

当奶山羊处于热应激环境中时，体内抗氧化系统功能发生紊乱，FR在体内大量聚集且抗氧化酶清除FR的速率下降，造成机体损伤。研究指出，花青素不仅可直接消除体内多余的FR数量，而且有通过激活Nrf2-ARE信号通路，间接抑制NF-κB活性，提高反刍动物机体抗氧化性能的潜在作用，从而缓解机体热应激[3]。目前，花青素研究主要围绕单胃动物或其他草食动物展开，反刍动物亦多以瘤胃体外产气实验为主，现有研究鲜见花青素缓解奶山羊热应激的报道。因此，本试验旨在研究富含花青素PSS对热应激奶山羊能量利用、血浆代谢和抗氧化参数的影响，为广泛应用这种新型绿色非常规饲料资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用4×4拉丁方试验设计，选取8只体况良好的经产萨能奶山羊[体重(41.50±1.84) kg；平均数±标准差]随机分为4组，四种日粮处理分别为(粗饲料均占日粮干物质50%)：粗饲料为稻草日粮组(NC)、黏玉米秸秆青贮饲料(sticky corn stover silage，SSS)组(PC1)、SSS+1 g/d商业紫玉米花青素提取物组(PC2)与紫玉米秸秆青贮饲料组(AR)，见表1。每个处理组8个重复(n=8)。每期试验周期持续21 d，其中最后7 d为样品采集期。紫玉米花青素提取物购于南京草本源生物科技有限公司。通过高效液相色谱仪检测，PSS总花青素水平高于SSS(74.55 mg/100 g DM vs. 28.65 mg/100 g DM)。羊只单笼饲养，自由采食和饮水，分别于08:00与17:00饲喂饲粮。羊只营养需要参考NRC[5]，各组饲粮均一次配齐并置于干燥通风处保存。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)%

1.2 检测指标

1.2.1 温湿指数

将温湿度记录仪悬挂于羊圈中部与羊只等高处，测定试验周期每天06:00、14:00和20:00舍内的温度和相对湿度，根据Minka和Ayo[6]计算温湿指数(THI)。数据显示试验周期内，羊舍全天平均温度为26.10～37.20 ℃，总平均温度为30.54 ℃；全天平均湿度为44.00%～94.00%，总平均湿度为72.66%；全天平均温湿指数为76.55～90.12，总平均温湿指数为82.28。因此，试羊处于中重度热应激环境范围。

1.2.2 饲粮营养成分

利用四分法将配好的各组试验饲粮采集500 g于65 ℃烘箱中烘干后，室温回潮24 h过1 mm筛粉碎转入自封袋制备风干样。参照AOAC[7]测定饲粮干物质(DM)、有机物(OM)、粗蛋白质(CP)、总能(GE)、中性洗涤纤维(NDF)及酸性洗涤纤维(ADF)。运用Parr 6200全自动氧弹量热仪分析样品能量。

1.2.3 玉米秸秆青贮饲料蛋白和能量价值参数

检测玉米秸秆青贮饲料的中性洗涤不溶蛋白(NDICP)、中性洗涤不溶氮(NDIN)、酸性洗涤不溶蛋白(ADICP)、酸性洗涤不溶氮(ADIN)；维持水平总可消化养分(TDN1X)、维持水平消化能(DE1X)、生产水平消化能(DEP)、生产水平代谢能(MEP)和生产水平泌乳净能(NELP)预测参照文献[8]。每个样品平行测定3次。

1.2.4 能量代谢参数

每期最后7 d进行消化代谢试验，全收粪尿法收集粪样及尿样，每天准确称量鲜粪并混匀，取10%作为样品装入自封袋中，尿液经4层纱布过滤后记录体积，取10%作为试样，每期的粪样和尿液混合均匀后置于-20 ℃保存备测。待试验结束后，将粪样置于65 ℃烘箱中烘至恒重，室温回潮24 h过1 mm筛粉碎转入自封袋制备风干样，尿样解冻测定能量。通过公式计算能量平衡状态。消化能(DE)=总能(GE)-粪能(FE)；代谢能(ME)=DE-尿能(UE)-甲烷能(Eg)；总能表观消化能=DE/GE×100%；总能利用率=ME/GE×100%；消化能利用率=ME/DE×100%。

Eg根据Pelchen和Peters[9]方程预测。

Eg/GE=1.3+0.112D+L(2.37-0.05D)

式中：Eg/GE为甲烷占总能的百分比(%)；D为总能消化率(%)；L为饲养水平(维持饲养的倍数)。

1.2.5 血浆代谢与抗氧化参数

在每个周期的20 d，通过K3-EDTA VACUETTE©真空管于晨饲前(0 h)和饲喂后(2、4 h)从颈静脉采血10 mL，于1 788.6×g 4 ℃离心机离心15 min，上层血浆转移至1.5 mL试管，储存在-80 ℃备测。葡萄糖(Glu)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、胱甘肽S-转移酶(GST)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购于Sigma-Aldrich公司。

2型糖尿病（T2DM）是一种临床常见的代谢紊乱疾病，其主要特征为慢性高血糖以及高血糖致使的多器官损害并发症。T2DM的特征性病理生理损害为胰岛B细胞功能失调以及机体的胰岛素抵抗（IR）。T2DM引起的最常见的病理改变包括糖尿病神经病变以及糖尿病血管病变，这两种病变成为糖尿病慢性并发症的基础。

1.3 数据统计分析

用Excel 2010对数据进行基本整理后，试验数据采用SAS 9.1.3统计分析软件中的MIXED模板进行统计学分析，统计分析模型为：Yij(k)=μ+Ri+Cj+τ(k)+εij(k)，式中：Yij(k)为观测值，μ为总平均值，Ri为周期随机效应，Cj为奶山羊随机效应，τ(k)为组别固定效应，εij(k)为均值为0，方差σ2的随机误差。差异显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 蛋白和能量价值参数

由表2可知，SSS和PSS的蛋白和能量价值参数(NDICP、NDIN、ADICP、ADIN、TDN1X、DE1X、DEP、MEP和NELP)差异均不显著(P>0.05)。

表2 紫玉米秸秆青贮饲料的蛋白和能量价值参数

2.2 能量代谢参数

各组间干物质采食量(DMI)差异不显著(P>0.05)，见表3。相似地，4组间GE摄入量、UE、Eg无显著(P>0.05)差异。NC组FE显著(P<0.05)低于PC2组和AR组。与其他组相比，NC组显示较低水平(P<0.05)的DE、ME、DE/GE和ME/GE。特别地，AR组ME/DE显著(P<0.05)高于其他组。

表3 紫玉米秸秆青贮饲料对奶山羊能量代谢的影响

2.3 血浆代谢和抗氧化参数

由表4可见，对Glu，NC组显著(P<0.05)低于PC2组和AR组。4组间山羊血浆AST和ALT差异均不显著(P>0.05)。PC1、PC2和AR的UN显著(P<0.05)低于NC组。对GST，PC2与AR组间差异未达显著(P>0.05)水平，但均显著(P<0.05)高于NC和PC1组。不同地，PC2与AR组间差异未表现差异显著(P>0.05)，但均显著(P<0.05)低于NC和PC1组。

表4 紫玉米秸秆青贮饲料对奶山羊血浆代谢和抗氧化参数的影响

3 讨论

3.1 紫玉米秸秆青贮饲料的蛋白和能量价值参数

能量是衡量饲粮营养价值重要指标之一，通过检测奶山羊PSS的蛋白和能量价值参数，可综合评价PSS的内在品质。花青素是一种有效的抗氧化剂和FR清除剂，有保护植物免受外界生物和非生物胁迫损伤的作用[10]。此外，自然界的花青素均以糖苷形式存在，花青素中的糖苷可能参与碳水化合物代谢，有为机体提供能量的潜力[11-12]。但是，花青素对山羊机体能量代谢的调控机制研究鲜见报道，尚待进一步研究与验证。Suksombat和Junpanichcharoen[13]试验指出，反刍动物摄入高浓度NELP的粗饲料，机体也会表现较高水平的NELP，更有利于机体的泌乳性能。本研究发现，SSS与PSS各项能量价值参数(DE1X、DEP、MEP、NELP)差异均较小，一方面，表明饲予PSS不会降低奶山羊能量需要，影响产奶量，为花青素缓解机体热应激奠定基础；另一方面，说明在给奶山羊提供能量方面，两者粗饲料的功能可能基本相同，可以实现能量相互替换[14]。

3.2 紫玉米秸秆青贮饲料对奶山羊能量代谢参数的影响

反刍动物汗腺不发达，处于高温环境下的山羊难以通过皮肤蒸发散热调节体温，更易发生热应激，影响生产性能。一方面，热应激奶山羊降低DMI摄入，不能满足机体能量需要，消耗组织维持机体需要。另一方面，热应激奶山羊加快皮肤和肺部血流量，减少胃肠道血流量，导致胃肠黏膜和细胞受损，降低营养物质的消化吸收。奶山羊更喜食甜味饲粮，花青素较苦涩，可能降低动物的采食量。本研究显示各组间DMI差异较小(表3)，说明PSS不降低热应激奶山羊适口性。有趣地，与PC2比，AR组山羊显示更高水平消化能利用率，可能与植物和提取物花青素在反刍动物中的代谢吸收效率差异有关[15]。研究发现，花青素既能有效清除体内过多FR，协助机体修复损伤细胞，促进细胞新陈代谢；又可促进谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的分泌，加强机体自身清除FR的能力[2]。据本实验数据可知，富含花青素PSS有提高奶山羊消化能、代谢能、总能表观消化率、总能利用率及消化能利用率的作用，因此，花青素有改善机体能量代谢的潜力。自然界少见游离的花青素，常与一个或多个葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖结合形成，花青素结构中糖类物质可能参与奶山羊中的能量代谢途径，进一步有提高体内抗氧化酶活性、抑制体内FR数量的作用，这也是将来研究热点之一。

3.3 紫玉米秸秆青贮饲料对奶山羊血浆代谢和抗氧化参数的影响

肝脏是机体重要解毒器官，转氨酶可用来判断肝脏损害程度，是检测肝功能重要指标。热应激增加反刍动物细胞膜通透性，胞浆内转氨酶释放入血，增加肝脏代谢负担。研究发现，动物能量摄入与血浆AST和ALT水平呈正相关关系[16]。Hosoda等[17]试验指出，泌乳期奶牛补饲富含花青素紫玉米青贮饲料对ALT无显著性影响，但可显著降低血浆AST的浓度，这可能与摄入能量水平有关。本研究中，各组日粮等能等氮，且DMI差异不显著(表3)，因此，奶山羊补饲PSS/紫玉米提取物不影响血浆AST和ALT浓度，说明PSS对热应激试羊肝脏代谢无副作用影响。

血液UN含量是动物机体蛋白质代谢的主要终末产物之一，高分解代谢状态可引起UN含量升高。热应激降低奶山羊消化机能，可导致饲粮蛋白质在瘤胃中降解为氨，经由瘤胃吸收进去血液造成氨浓度升高，进而转化为尿素排出体外。本实验发现PC1、PC2、AR组显示较高水平的能量利用效率(表3)，因此，在奶山羊饲粮中饲喂PSS对肝脏代谢负担无副作用影响。Hosoda等[17]研究显示，泌乳奶牛饲喂富含花青素紫玉米青贮饲料，显示较高水平血浆UN，可能与饲粮较高水平蛋白质有关。本研究所有试羊在饲养周期均处于健康状态，饲粮蛋白质水平一致，因此血浆UN水平无显著性差异。

动物发生热应激，易造成肠道内缺氧缺血，诱发内源性FR产生，FR可根据刺激机体时间的长短与氧化应激的程度诱导相关信号通路，影响机体健康。研究表明，花青素作为Nrf2的活化剂，可直接修饰Keap1存在的传感器半胱氨酸，激活Nrf2并诱导具有抗氧化功能的细胞保护蛋白；同时间接抑制NF-κB信号通路，降低相关炎症因子的基因表达，达到提高反刍动物抗氧化性能的作用[3]。因此，花青素可通过增强机体Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和GSH-Px 等mRNA表达提高动物抗氧化能力[18]。GST是机体解毒过程的关键酶，催化谷胱甘肽结合反应起始步骤。本试验结果显示，在奶山羊饲粮中补饲PSS或紫玉米提取物可显著增强血浆GST浓度。GSH参与体内氧化还原过程，可与过氧化物或FR反应，减弱氧化应激。花青素没有提高热应激奶山羊血浆GSH作用，可能是SOD将毒性更高的超氧阴离子自由基转化为毒性较低的过氧化氢，对热应激奶山羊已有缓解作用[2]。MDA是氧化反应终产物，可引起核酸、蛋白质等生命大分子交联聚合，降低机体抗氧能力。花青素能为FR提供电子，预防FR氧化邻近细胞，保持处于氧化应激状态时宿主动物FR平衡。因此，PSS或紫玉米提取物可显著降低血浆MDA水平。这说明花青素可提高奶山羊血浆抗氧化酶的活性，减少机体过程中FR和过氧化物等的生成，有提高机体抗氧化性能，进一步缓解奶山羊热应激的潜力。Ngo Thi[19]报道，饲予生长肉羊富含花青素象草青贮饲料有提升血浆GST和GSH，降低MDA水平的趋势。Hosoda等[20]试验表明，在绵羊饲粮中补饲富含花青素青贮稻草有改善机体血浆抗氧化酶活性的作用。