羊乳制品中掺杂牛乳鉴别技术研究进展

李婧妍，安乐，韩波，张瑞雪，张静雅，2

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院农业农村部食品质量监督检验测试中心，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

0 引 言

羊乳富含多种维生素、矿物元素、短链脂肪酸以及大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白结构成分与母乳基本相同，被营养学界称为“奶中之王”。其乳脂肪球微粒小、乳糖含量低，易于被人体吸收，长期饮用不会导致肥胖。羊乳还含较少的致敏性αs1-酪蛋白（αs1-CN）和乳球蛋白（β-Lg），可作为牛乳不耐受人群或胃肠较弱和体质较差婴儿的良好乳源[1]。但羊乳及其制品的成本比牛乳高很多，两者价格相差大概一倍。在利益驱动下，羊乳、羊酸奶、羊奶粉和羊奶酪等制品中掺杂牛乳现象非常普遍，这对一些牛乳过敏者可能造成伤害，也严重影响羊乳市场健康发展。要杜绝这种乳源掺假现象，关键问题之一是要建立快速准确的鉴别手段。目前，鉴定羊乳及其制品中是否掺杂牛乳的检测方法主要依据两者蛋白质、DNA分子和脂肪酸组成等特征指标构建，所涉及的检测技术包括电子鼻法[2]、光谱法[3]、酶联免疫法（EILSA）[2-8]、PCR法[9-26]、电泳法[27-33]、色谱及色谱-质谱法[34-37]和蛋白质组学法等[38-42]。其中ELISA法、PCR法、电泳检测法、色谱及色谱-质谱法和蛋白质组学法是近年来鉴伪能力最为精确、检测手段最先进的方法，本文综述了这5种鉴别方法的特征和适用性，旨在为后续研究提供参考。

1 ELISA检测技术

ELISA方法是基于牛源蛋白抗原特异性实现的，因此牛源性抗原的选择是方法建立的关键。乳蛋白以酪蛋白和乳清蛋白为主，其中乳清蛋白由β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白(α-La)、血清白蛋白（BLA）、免疫球蛋白（IgG）和乳铁蛋白等组成；酪蛋白（CN）由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN组成。抗原的选择一般要求在牛乳中丰度高且稳定，一般选择αs1-CN、β-CN、IgG等单一蛋白分子，且需具有较高的种属特异性决定簇，即牛源性抗原产生的抗体不会与其他种属抗原结合，只专一性结合牛乳中的蛋白。

抗体的制备是建立ELISA的另一个关键，包括多克隆抗体和单克隆抗体两类。通常认为羊抗牛适合检测羊乳中的牛乳成分，因为羊的免疫系统对自身抗原免疫耐受，因此羊抗牛抗体不会交叉结合羊乳蛋白。Anguita[4]和Hurley[5]等分别用牛β-CN和IgG制备牛源性单克隆抗体并建立间接ELISA反应体系，专一性结合牛源蛋白，其最低可检出0.5%的掺假率。薛海燕[6]和Song[7]等将制备的牛β-CN多克隆抗体与羊β-CN进行免疫吸收封闭，以提高抗体特异性，制备的多克隆抗体均可特异性识别牛β-CN的某些特异性表位，且对牛α-CN、κ-CN和乳清蛋白无交叉活性，掺假牛乳的最低检出量在2%～4%之间，且热处理对制备的抗体也无显著影响，表明该方法在灭菌乳的检测中同样适用。在多克隆抗体研究中，张世伟[8]等以牛IgG和其Fc片段为抗原，制备抗牛IgG的多克隆，并将以此蛋白作为包被抗体构建双抗夹心ELISA方法。该方法无需复杂的前处理即可准确检测牛乳含量，方法灵敏度可达到0.1μg/mL。ELISA技术具有高灵敏、高特异性、快速等优点，不需昂贵仪器设备，特别适合对大量样品的筛检，如果ELISA试剂盒的研发成功，可推广到小型乳品企业和基层实验室，提高检测效率，降低操作人员工作难度。但ELISA分析也存在之一些缺陷，例如对试剂的选择性高，且对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应等。

2 PCR检测技术

ELISA检测在生鲜乳中应用效果较好，但市售的乳制品大多经过高温高压处理，并添加多种食品添加剂，导致蛋白质结构和稳定性发生改变，特有蛋白或抗原决定部位也发生相应改变。而以动物种属间遗传信息差异作为物种鉴别靶标的PCR检测法具有良好的耐高温性，不仅可以检测原料乳，也可检测加工处理后的的高温灭菌乳、酸乳和乳酪等制品。泌乳过程中脱落到乳中的体细胞（1×104～1×107/mL）内含有遗传物质DNA，可提供乳源的有效信息。羊乳制品引入牛源成分的同时也引入该种属特异性遗传物质，因此可通过样品中是否存在牛源PCR产物进行掺伪鉴定[9]。Plath等[10]最先将PCR方法用于羊乳和羊乳干酪中牛源成分的鉴定，在对基因组DNA中β-CN部分序列扩增时发现，山羊和绵羊乳β-CN DNA中存在牛乳不存在的限制性内切酶位点，如果掺杂了牛源成分，在选择性限制酶分析和PAGE后，牛源性样品中未被消化水解的β-CN会出现谱带，该方法最低可检出0.5%牛源成分。

利用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）技术，Abdel-Rahman[11]等人建立了绵羊乳源中水牛乳和普通牛乳的鉴定方法。不同种属的生物个体DNA序列存在差别，PCR-RFLP技术是利用同一种限制性内切酶切割下不同物种DNA序列，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片。

水牛和普通牛乳扩增出603 bp大小的基因片段，羊乳扩增出374 bp大小的特异性条带。该技术还可对水牛乳和普通牛乳进行进一步鉴定，对两种牛乳线粒体细胞色素b（cyt-b）扩增产物进行酶切，发现水牛乳经限制性内切酶Taq I酶切PCR产物后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测出两条明确酶切条带（191 bp和168 bp的片段），而普通奶牛乳没有被酶切，条带仍然为603 bp。因此，可根据是否存在这两条酶切条带准确进行种属鉴定，最低可检出绵羊和山羊干酪中掺入0.5%牛源成分。Lanzilao等[12]同样用PCR-RFLP和琼脂糖凝胶电泳结合对cyt-b基因进行扩增，可鉴定混合乳中奶牛、水牛、山羊和绵羊乳成分。

在目的基因选择方面，很多研究认为线粒体DNA（mt DNA）比核基因组DNA更适合物种鉴定。因为mt DNA基因组结构在物种间高度保守，一级结构有很大差异，并且在细胞中的复制数量较多，可得到有效扩增，更适合于物种的鉴定研究。另外，线粒体特异序列区（D-环区、cyt-b）和保守序列区（12SrRNA，16SrRNA）也常用来作为目的基因。Maudet[13]、De[14]、Bania[15]和López-Calleja[16]等分别设计牛种属特异性探针对线粒体D-环区、cyt-b和12S rRNA进行扩增，产物经琼脂糖凝胶-EB染色后，其牛乳检出限均可达到0.1%以上。

多重PCR检测技术也是检测食品掺假的有效手段，该技术在同一PCR体系中加入不同种属特异性基因的特异性引物，可同时扩增多个模板的不同区域，得到相应的而不同长度的PCR产物，以此来检测目标物是否存在。Kotowicz[17]、Botter[18]和López-Calleja[19]等在同一PCR管中均实现了对普通牛乳、山羊乳和绵羊乳线粒体保守序列区（12S rRNA和16S rRNA）特异性片段的同时扩增，建立了3种乳源的多重PCR快速检测方法。在灵敏度方面，多重PCR与单重PCR具有相同的检测灵敏度。

经过高温处理的乳制品，其DNA降解为许多仅有几百个碱基的小片段，如果检测目的片段太大，可能无法发现阳性片段，而受电泳检测有效性的限制，传统PCR难以采纳小片段目的产物。实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现整个PCR过程的实时监测，在扩增的指数期对起始模板进行定量分析，对小片段目标产物可以准确定量。RT-PCR法不但具有常规PCR敏感度高、污染概率小等优点，同时也可通过一次扩增同时检测多个靶标基因。另外，实时定量PCR不需要对PCR产物进行凝胶电泳，可快速、高通量扩增，在检测动物源性成分中得到广泛的应用。目前，荧光标记的方法有两种，非特异性荧光标记（SYBR Green I法）和特异性荧光标记（Tapman探针法）。

SYBR Green I是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，产生的荧光信号和双链DNA分子数成正比，具有快速、灵敏、低成本和高通量等优点。Liao等[20]设计牛特异性探针12SBT-REV，对线粒体12SrRNA序列中346 bp进行扩增，产物用琼脂糖电泳和荧光SYBR Green RT-PCR进行鉴定。Agrimonti等[21]基于该染色法，使用四重实时定量PCR技术建立了可同时鉴定鲜乳和干酪中奶牛、山羊、绵阳、水牛4种乳源的快速定性方法，并可对其中奶牛DNA进行定量，定量限为0.1%。

Taqman法是用特异性荧光探针识别和检测扩增产物，所得数据更为精确。该研究大多参照牛、山羊和绵羊线粒体基因组中高度保守的16S rRNA、12S rRNA、cyt-b的种内保守中间特异性区域作为牛羊特异检测的靶序列，设计样品通用引物序列和特异分子信标探针后（常用的探针有FAM、HEX荧光探针、淬灭基团为TAMRA），通过优化反应体系中的引物浓度、探针浓度和退火温度等条件，建立能同时检测羊牛乳成分的荧光定量PCR体系[22-25]。这类方法对纯DNA含量的最低检出浓度为0.01 ng，对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。也有研究不提取DNA[26]，经核酸释放剂处理后，直接进行荧光定量PCR检测鉴定羊奶粉中的牛源性成分。

PCR检测技术是羊奶掺假研究最多的检测方法，具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点。传统PCR法需对PCR产物进行凝胶电泳才能完成整个检测，一旦遇到可疑阳性结果，必须进行酶切鉴定。实时荧光定量PCR不需后处理，克服了普通PCR假阳性问题和交叉污染，也不受掺假形式的影响，可自动实时检测分析，已在动物源性成分检测项目上取代一般PCR方法成为最为常用的分子生物学检测的手段。荧光PCR技术在乳源检测的运用过程中也受到一些限制，主要是因为各种乳品经过不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破坏，并且在生产过程中混入不同的添加剂和佐料，使食品的成分更加复杂。

3 电泳检测技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）具有分子筛效应，能够有效分离乳中主要蛋白质，可依据不同乳源蛋白分子量差异同时进行定性和定量分析。Pesic[27]以全乳和乳清蛋白为样品，以牛源β-Lg、α-La为目标物，利用未变性-PAGE技术比较混合牛羊乳中电泳条带强度，对牛乳含量进行分析，结果显示牛乳在山羊奶中检出限为3%，在绵羊奶中为5%。阿力木等[26]以不同乳源的乳清蛋白为样品，利用SDS-PAGE电泳技术分离乳清蛋白，确定羊乳与牛乳差异性蛋白为乳铁蛋白，并通过灰度分析定量掺伪比率。然而，PAGE具有一定的局限性，耗时长、劳动强度大，且对小分子物质的检测能力弱。

毛细管电泳（CE）是基于被分离物质的荷质比差异，在电场力作用下，可根据目标物在缓冲溶液中的迁移速度不同实现分离。对于结构相似但电荷不同的多肽蛋白，通过调节pH值、改变溶质电荷和淌度达到分离目的。CE技术能够快速、可靠地分离乳中酪蛋白和乳清蛋白，且仅使用少量样品和缓冲液即可获得高分辨率和良好的定量结果，已成功应用绵羊和山羊乳中掺杂牛乳的鉴定[29]。Trimboli[30]、刘鸣畅[31]、Muller[32]等建立了不同的缓冲体系，通过CE蛋白迁移图谱选择目标蛋白进行掺假定量分析。Cartoni和Trimboli等在pH 9.0-10.0的硼酸钠缓冲环境中分别分离出牛β-Lg A和αs-CN为特征目标物；刘鸣畅等建立了2%SDS缓冲液体系，发现牛乳中β-CN可作为牛乳目标物，可鉴定婴幼儿配方羊乳粉、乳清粉中0.5%的牛乳掺杂量。Muller等在高离子强度的酸性环境（pH 1.9），以非牛β-Lg在牛羊混合乳中的比例为基础，结合质谱联用技术建立了测定牛乳掺假量的方法。

等电聚焦电泳法（IEF）也可用于乳制品掺假，其原理是通过两性电解质建立一个pH梯度环境，电泳时蛋白质迁移到其相应的等电点的pH处形成区带，从而实现目标物分离。[33]等用IEF法检测羊乳干酪中牛乳掺假，对酪蛋白进行分离后，对β-Lg水解产物γ-CN进行等电聚焦，可定量检测牛乳中γ-CN含量，检出限为1%。该方法在新鲜干酪和热加工再制干酪中均具有较高的鉴伪能力。与其他检测技术相比，电泳法具有分离模式多、分析时间短、分辨率高，样品和试剂消耗极少等优点。但电泳分析法操作繁琐费时，需对电泳条带分析以表明各种蛋白质的相对分布，对目标蛋白的定量难以精确，且制备能力差。但如果能在电泳技术基础上研发检测试纸，则可作为初步鉴定掺伪乳源的手段。

4 色谱及色谱-质谱联用技术

色谱及色谱-质谱联用技术在掺假鉴定中主要通过对乳蛋白进行定性识别。单独使用色谱技术分析时，目标物为牛羊乳中不同的酪蛋白，主要依据α-CN、β-CN和κ-CN在反相HPLC中和固定相结合能力不同进行分析。Veloso[34]等利用HPLC定量分析生牛乳、绵羊乳和山羊乳中α-CN、β-CN、κ-CN含量，指出牛羊乳中α-CN含量存在显著差异，该方法可对掺杂了5%牛乳的羊乳进行定量。作者还对该方法在干酪成熟30 d过程中的稳定性进行了分析，结果稳定可靠。Natercia等[35]用疏水色谱法（HIC）对生牛乳、山羊乳和绵羊乳及其乳酪制品中αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN进行分离，通过对αs1/κ-CN、αs2/β-CN、β/κ-CN和αs1/αs2-CN峰面积比值对掺杂比率进行分析，其检出能力最低为2%。

色谱-质谱联用技术中，首先依托HPLC对乳蛋白进行分离，再利用蛋白图谱特征指标变化结合基质辅助激光解吸电离-飞行之间质谱（MALDI-ToF）或电离质谱（MALDI-MS）等技术联用实现。质谱技术所需样品量小，能够检测到相当高的肽段数量和氨基酸序列，在蛋白质识别和定量方面具有较高的可信度和灵敏度。Nicolaou等[36]利用MALDI-ToF-MS技术对牛乳、山羊乳和绵羊乳分别进行蛋白图谱扫描，用偏最小二乘法和非线性核最小二乘法对牛乳掺入羊乳比例与蛋白谱图中特征指标变化趋势的相关性进行分析，发现羊乳中掺杂牛乳比率与这些特征指标的变化呈正相关。在判定山羊乳中牛乳含量时，以蛋白谱图中β-Lg与α-La比值作为特征指标；判定绵羊乳中牛乳含量时，以绵羊乳中特有的γ2和γ3酪蛋白为特征指标，该方法最小可检测5%掺杂比率。对于质谱法经常出现的基质效应问题，Ke等[37]用同位素内标法对基质效应进行补偿，以4种酪蛋白（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）和两种乳清蛋白（β-Lg、α-La）为目标物，用HPLC-MRM技术筛选其水解特征肽段作为掺假标志物，对特征肽进行了定性和定量分析，该方法在山羊乳和绵羊乳乳清蛋白粉和婴幼儿配方奶粉中掺假牛乳目标蛋白检出限0.01～0.05 g/100g，回收率82.3%～116.6%。

超临界流体色谱-四级杆飞行时间质谱（SFC-Q-TOF-MS）联用技术也成功应用于掺伪鉴定中，主要依据游离脂肪酸酯化到甘油分子骨架的不同位置，通过分析牛羊乳中复杂的甘油三酯（TAG）组成来判断乳源类型[38]。乳脂中的三酰甘油成分复杂，采用标准品定性困难，而通过Q-TOF-MS提供的精确质量数与丰富的碎片信息识别牛羊乳中TAG组成差异则是一种快速鉴定手段。该方法共鉴定出55种TAG，其中牛乳48种，羊乳53种，并指出其酰基链总碳数和双键数量均存在差异。其中羊乳中短链TAG和长链TAG含量较牛乳多，且不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸含量）较高。应用主成分分析法（PCA）处理SFC-MS数据发现，两种样品较好地分布在两个区域，表明其存在较明显的差异。其中区分羊奶样品的重要TAG指标为：O-P-O、O-P-C、O-P-L、O-S-O和P-Co-C；区分牛奶样品的重要TAG指标为：P-P-Co、O-P-Co、O-M-Co、O-Bu-O和O-P-P。

与其他技术相比，色谱质谱法的优势是不可替代的，检测方法的高通量是掺假快速检测的最佳选择，而且色谱和质谱法的操作也越来越智能化。且针对牛乳过敏人群的产品，尤其是婴幼儿配方羊乳粉产品的检测中，利用色谱和质谱技术进行痕量分析是十分必要的。但色谱质谱研究的最大问题在于食品复杂的基质对仪器的灵敏度有很大影响。另外，色谱和质谱类仪器昂贵，前处理操作复杂，对分析操作人员要求较高，仅适合用于大型乳品企业和监管部门等进行掺伪鉴定。

5 蛋白组学检测技术

蛋白组学作为后基因时代的一个新的研究手段迅速发展，已成为鉴别各类功能性食品或高附加值食品真伪的有力研究工具。目前，蛋白质组学技术已被成功应用到乳及乳制品掺假研究，主要还是通过对乳清蛋白（β-Lg、α-La）和4大酪蛋白家族（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）进行分离鉴定。牛羊乳种属间差异乳蛋白进行组学研究，不仅可对乳源蛋白含量及变化进行鉴定，也可对乳蛋白的糖基化、磷酸化等翻译后修饰的改变进行特征性描述。Stepanka等[39]比较了MALDI-TOF-MS和LC-ESI-TOF技术在乳源掺假中的鉴定能力，并结合主成分分析法和蛋白数据库对捷克市场上常见的27种羊乳干酪的真实性进行了鉴定。结果发现MALDI-TOF法仅能区别部分掺假样品，而应用LC-ESI-TOF技术发现牛α-s-CN的特异性序列可作为标记物鉴定羊乳中是否掺杂牛乳。

Camerini[40]等用MALDI-MS和LC-MS/MS技术联合检测水牛、绵羊和山羊乳清制作的Ricotta干酪中掺杂奶牛乳的含量。将提取的乳清干酪蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离，胰蛋白酶水解，获得的多肽溶液经反相HPLC-MS/MS技术进行定性和定量分析。发现奶牛乳β-LG的C-末端肽（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.4）与其他乳源均有差异，且在质谱中响应值高，可作为奶牛乳清的特异性肽，其最低检出能力为0.5%。Chen等[41]同样以β-Lg作为目标蛋白，同样发现牛（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.6/462.2）和羊（LAFNPTQLEGQCHV,m/z807.5/600.2）种属特异性肽可分别作为区分牛羊乳的指标。Bernardi[42]等使用Up-down分离法和HPLC-MS/MS结合的蛋白质组学技术筛选出山羊乳、绵羊乳、水牛乳和奶牛乳的种属特异性肽。用胰蛋白酶直接水解全乳样品，经HPLC-MS/MS鉴定和Mascot软件分析蛋白水解肽的组成和分子量，发现αs1-CN gi/311943的一个肽段（YLGYLEQLLK，m/z 620.3）可作为山羊乳水解肽的标记物以区分绵羊乳和牛乳；另一个m/z830.9的未知蛋白肽段（MSHLVLSNVGISFTR）可作为牛种属特异性肽作为判断掺假的标记物。该方法在干酪生产加工和后熟过程中同样适用。蛋白质组学能为乳源鉴伪提供系统性信息，不仅能够用于乳源鉴伪，还能用于乳源品质认证，是鉴伪工作中最为精准的技术手段，可作为仲裁和出入境检测过程中的有效工具。该方法的局限性是检测成本和对检验人员的技术要求很高，且仪器设备的使用和后期维护产生较大的费用。

6 结 论

本文从检测的目标成分、检测手段、结果灵敏度以及检测效率等方面对羊乳中掺杂牛乳的检测方法进行了论述。ELISA和电泳技术有着较高的准确度，如能依据其反应原理制成检测试剂盒或试纸，则可用于生产过程批量定性检测。但试剂盒或试纸的研发需要投入大量的精力，需要研究人员付出很多的努力。PCR检测方法以DNA检测为依据，灵敏度和特异性均较高，可检出痕量牛乳含量。但该方法前处理时间较长，不适用于快速检测，一旦样品感染乳腺炎，体细胞数量易受到炎症污染，将无法进行鉴定。色谱-质谱技术以及蛋白组学技术是当今发展最快、也是最为准确的检测手段。这类技术是以牛羊乳蛋白之间结构和性质差异为依据，并基于这些差异性进行分离、区别和鉴定，可反应乳蛋白各种特征的真实情况，具有其他研究方法不可取代的优势。文中总结的5种研究方法、技术手段以及适用性各不相同，旨在为羊乳掺假检测研究提供更多的思路，使乳源鉴伪研究不局限于单一研究方法和单项检测结论，且在鉴定过程中，也很可能需要多种检测方法相互辅助才能得到可靠的实验结论。