分子生物学技术在检测机构食品微生物检测中的应用现状、技术制约因素与发展趋势

丁卫平，杨夕宇，朱可滢，蔡双凤*

(1.滨州市食品药品检验检测中心，山东 滨州 256600；2.华侨大学 生物医学学院/医学院，福建 厦门 361021)

食源性疾病的暴发与食品受食源性微生物污染密切相关。据文献报道，在食源性疾病疫情中，由微生物引起的暴发事件起数和发病人数最多[1]。 不仅如此，从食品安全长远发展来看，农兽药残留以及非法添加物等食品安全问题是国民经济发展到特定阶段必然出现的问题, 也会随着国民经济的发展和农业生产方式的转变而弱化，但是致病微生物却将长期存在，并将是国民经济进一步发展后食品安全的主要问题[2]。要保障食品安全，离不开食品中微生物的精准检测。出于对食品中微生物可能引起的食品安全问题的担忧，人们一直在研究食品微生物检测的相关技术，分子生物学相关技术就是研究的重点之一[3-4]。下面首先对分子生物学技术在检测机构食品微生物检测中的应用现状进行总结。

1 分子生物学技术在检测机构食品微生物检测领域的应用现状

根据国家食品安全监督抽检实施细则要求，我国目前各检测机构一般采用国家标准来检测判定食品中的微生物[5]。从当前的食品微生物检测国家标准来看，对于致泻大肠埃希氏菌的检验，GB 4789.6-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》要求[6]，生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落需要进行PCR确认试验；GB 4789.12-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验》要求[7]，对于肉毒梭菌的检验，生化反应符合肉毒梭菌的菌落需要进行毒素基因检测，以确定肉毒梭菌具体类型；对于大肠埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的测定，GB 4789.36-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》中规定此项检验属于选做项目[8]；对于诺如病毒的检测，GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》则要求采用实时荧光RT-PCR方法检测[9]。

以上是采用分子生物学技术进行微生物检验的强制性国家标准，如果把采用分子生物学技术进行检验的标准拓展到推荐性国家标准、行业标准、地方标准，那么采用分子生物学技术的标准数量将大大增加，这些标准用到的分子生物学技术有常规PCR、荧光定量PCR、数字PCR、基因芯片等。

出入境检验检测机构由于要与国际接轨，因此其对新技术的运用要超前一些，采用分子生物学技术进行检验的行业标准数量也比较多。对于国内检测机构来说，从GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》以及历年的国家食品安全监督抽检实施细则中可以看出[10]，当前的食品检测中，致病菌检测的重点是沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及大肠埃希氏菌 O157:H7。大肠埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的测定由于属于选做项目，检测机构做的比较少。其他重点检测的致病菌基本都按照国家标准使用传统的检测方法包括增菌培养筛选及后续计数检测、生化反应鉴定或血清学鉴定等环节，没有使用分子生物学技术。因此，虽然分子生物学技术在食品微生物检测中的研究日益走向深入，但是分子生物学技术在检测机构食品微生物检测中的应用仍然比较少。

2 分子生物学技术在检测机构食品微生物检测领域应用的技术制约因素

随着检验要求的提升和检验规模的扩大，食品微生物传统检测方法的缺点日益凸显，如由于不可培养微生物的存在，仅依靠培养手段，在生物多样性上不能反映微生物的真实状况以及检测周期长、检测流程复杂、特异性不足等缺点[11]。尽管存在这些缺点，但是新的技术并未完全取代原有的技术，这是因为新的技术也存在各种缺点。在一种技术的优越性未得到完全确认时，出于对食品安全的负责，监管部门不得不继续要求检测机构采用原有的较为成熟的技术。制约分子生物学技术在食品微生物检验中应用的因素有很多，下面仅对相关技术制约因素进行简单总结。

2.1 微生物死活的有效区分

与传统的微生物检验方法相比，采用分子生物学技术进行微生物检验可实现对不可培养微生物的鉴定，在这方面科学家进行了大量的研究并取得了一定的成果[12-13]。这是采用分子生物学方法进行微生物检验的优点之一，但采用此方法进行微生物检验同样存在不足之处，比如在食品微生物检验中应用最多的分子生物学技术是PCR技术，采用PCR技术检测食品微生物的主要缺陷是不能区分微生物的死活，从样品中提取的微生物即使死掉其DNA同样能作为模板进行特异性扩增, 因此在检测过程中会出现假阳性结果。开发快速、准确的活菌检测技术是食品微生物检测领域的一大挑战。当前国内外一些科学家在开发利用PMA/EMA-PCR技术，根据他们的文章报道[14-15]，这项技术能消除死去的微生物对PCR扩增的影响, 使扩增信号只来源于活的微生物，近年来这项技术已经开始进行探索性应用，但由于PMA(叠氮溴化丙锭)、EMA(叠氮溴化乙锭)毒性较大，污染消除也比较困难，大规模推广应用难度较大。

2.2 微生物难以有效富集的缺点

如果想利用分子生物学技术对食品中的微生物进行快速检测，菌体的富集分离技术必不可少。当前的菌体富集分离技术有离心分离技术、改良增菌培养基富集技术、膜分离技术及免疫磁性分离技术等，但这些方法大都存在一定的缺点。离心分离技术存在着粘附食品基质、大量细菌损失等缺点[16]。高质量的改良增菌培养基的研发比较困难。采用膜分离技术时分离后的菌体常浓缩于食品或滤膜上，还需要进一步洗脱和分离，并且洗脱效果严重影响着细菌的回收率[17]。使用免疫磁性分离技术时，由于食品基质复杂，微生物菌群复杂多样，对于抗体的干扰较大，选择的抗原靶标不特异，将导致富集到很多杂菌，无法正确检测到目标菌[18]。同时免疫磁性分离技术存在着成本高、需要预处理、不适合大体积样品分离等缺点。

2.3 微生物定量的缺点

微生物所造成的毒害作用不但与其类型有关，也与其数量密切相关，GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》对于食品中致病菌的限量都做了相关规定。因此，在进行食品微生物检测时，需要比较准确地检测食品中微生物的数量，而这恰恰是PCR等传统分子生物学技术的缺点之一。不过现在随着分子生物学技术的快速发展，科学家创造性地发明了数字PCR技术，这种技术是对起始样品的绝对定量，利用这种技术可以使得基于 PCR 技术的食源性微生物的检测真正成为定量检测[19]。但在当前，数字PCR检测的成本仍然比较高，相关技术更多地用于科学研究，在检测机构推广难度较大。

3 分子生物学技术在检测机构食品微生物检测领域的发展趋势

3.1 传统鉴定技术与分子生物学技术相结合

实际上，现在利用分子生物学技术进行检验的国家标准基本就是将传统鉴定技术与分子生物学技术相结合，比如致泻大肠埃希氏菌、肉毒梭菌的检验。这些微生物的检验一般都是先进行增菌、生化反应鉴定然后再进行分子生物学鉴定，传统的涂布平板法可以比较准确地对微生物数目进行定量，而分子生物学技术则可以对微生物进行快速定性，但在定量方面仍然存在不足，这种检验方法的好处是可以将两种技术的优势结合起来，这也是未来分子生物学技术用于食品微生物检验的发展趋势之一。

3.2 进一步挖掘现有技术的潜力

如果能将现有技术的潜力进一步发掘，可能会产生巨大的应用价值。比如数字PCR技术，这项技术具有能对样品DNA绝对定量的独特优势，但当前的一个缺点就是价格太高，这大大限制了其应用。如果随着科技的进步，这项技术的成本能够降下来，那么此项技术的应用范围会大大增加。再比如，如果能够将PMA等染料与数字PCR技术相结合，则能够实现对活菌的绝对定量。除此之外，微流控芯片、全自动PCR技术、液相芯片等技术也已经展现出了各自的独特优势[20-22]，需要进一步发掘这些技术的潜力加以推广应用。

3.3 新技术的开发利用

要利用分子生物学技术对食品中的微生物进行检测，一些配套的技术也必不可少，如增菌培养富集技术、DNA提取技术、菌体直接富集分离技术等，这些技术与最后的检测结果密切相关。当前这些技术都有很大的发展空间，需要科学家们进行进一步的研究。如果我们能够开发出高效率的没有前增菌过程的菌体富集分离技术，再配套分子生物学技术，就可以真正实现食品微生物的快速检测，这在发生食品安全事件时显得特别重要，可以使我们更快地确定病原体。

4 展望

任何一种技术都有其缺点，但科学就是在不断发现问题与解决问题中不断取得进步。分子生物学技术作为当前生物学领域发展最快、应用最广泛的领域，已经在食源性病毒如诺如病毒的检测中起着不可替代的作用，理应也能够在食品微生物检测领域发挥更大的作用。随着分子生物学技术及其他技术的发展，食品微生物检测技术必将迎来广阔的发展空间。