苏黄止咳胶囊对大鼠慢阻肺模型NF-ΚB p65、TLR4及IAP1表达的影响

2021-03-31潘宏达李艳平

中国中医基础医学杂志 2021年2期

秦丰，潘宏达，吕爽，李艳平，封红

(包头市第四医院呼吸内科,内蒙古包头 014030)

慢性阻塞性肺病(慢阻肺)可见呼吸气流受限不完全可逆且呈进行性发展，与肺部对香烟等有害气体的异常炎症反应有关[1]。慢阻肺和慢性支气管炎密切相关，呼吸道反复病毒和继发性细菌感染是导致慢性支气管炎病变的重要致病因素，大气污染也是引起慢性支气管炎的重要原因，机体的抵抗力下降、呼吸系统防御受损是发病的内在因素[2]。苏黄止咳胶囊由麻黄、紫苏叶、地龙、枇杷叶(蜜制)、紫苏子(炒)、蝉蜕、前胡、牛蒡子(炒)、五味子组成，具有疏风宣肺、止咳利咽的功效，用于风邪犯肺、肺气失宣所致的咳嗽、咽痒、气急、遇冷空气、异味等因素突发，多呈反复发作。本实验研究了苏黄止咳胶囊对慢阻肺模型的影响，为苏黄止咳胶囊的临床应用提供了药效学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠60只，体质量180～220 g，雌雄各半，购自内蒙古大学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(蒙)2016-0001。本实验已通过内蒙古大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 实验药物

苏黄止咳胶囊购自北京海燕药业有限公司，规格9粒/盒(0.45 g/粒)，每次3粒，每日3次；氨茶碱片(天津力生制药股份有限公司，每次1～2片，每日3～6片；水合氯醛、柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验试剂

多聚甲醛、二甲苯、无水乙醇、柠檬酸(购自天津大茂化学试剂厂)，PBS磷酸缓冲液(北京Solarbio科技有限公司)，TMS-P超敏试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司)，脂多糖(Sigma)，细胞核因子/k基因结合核因子单克隆抗体(nuclear factor kappa-B p65，NF-KB p65)，Toll样受体4抗体(Toll-like receptors 4，TLR4)、凋亡抑制因子1抗体(inhibitor of apoptotic protein 1，IAP1)(购自北京博奥森生物技术有限公司)。

1.4 实验仪器

BX53型显微镜(奥林巴斯中国有限公司);DHP-9032 35 L电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);KD-P型生物组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);切片机(德国徕卡)；动物肺功能分析系统(北京吉安得尔科技有限公司);YG-280KX烤片机(湖北贝诺医疗科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备

将60只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、苏黄止咳胶囊低剂量组(0.36 g/kg)、苏黄止咳胶囊中剂量组(0.72 g/kg)、苏黄止咳胶囊高剂量组(1.44 g/kg)、氨茶碱片组(0.01 g/kg)。除空白对照组外，其余各组大鼠均制备慢阻肺模型。于实验第1天和第15天滴鼻注入0.2 ml LPS(1 g/L)溶液[3]，每天给予烟熏，用10支香烟熏10只大鼠，每次熏30 min[4]。造模第28天后开始灌胃给药，每日1次，连续治疗4周，末次给药1 h，使用动物呼吸功能测定仪测定大鼠最大呼气流量(PEP)、1 s用力呼气容积(FEV1)[5]。实验结束后，取肺脏用4% 多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色及免疫组化染色。

2.2 肺脏HE染色

取肺组织于多聚甲醛溶液中固定24 h后，将肺组织从固定液中取出，脱水后石蜡包埋。石蜡切片经二甲苯透明，常规脱蜡至水。用苏木精染色5 min反蓝，0.5% 伊红液染色、脱水，二甲苯透明10 min，中性树胶封片，在显微镜下观察肺组织炎性细胞浸润并进行炎症病理学评分[6]。肺组织HE染色分级：0级：无炎症；1级：轻度炎症，炎性细胞浸润；2级：中度炎症，肺泡间隔增厚；3级：炎性细胞浸润，病变范围大于30%[7]。

2.3 免疫组化法检测肺组织NF-ΚB p65、TLR4及IAP1表达

石蜡切片经二甲苯透明，常规脱蜡至水。3% H202室温孵育10 min[8]。蒸馏水冲洗，PBS缓冲溶液冲洗3次，每次5 min。滴加10% 山羊血清封闭，室温孵育10 min倾去血清。滴加一抗(NF-ΚB p65抗体)，PBS稀释比例为1∶450；TLR4抗体，PBS稀释比例为1∶400；IAP1抗体，PBS稀释比例为1∶350，37 ℃ 孵育2 h。PBS缓冲溶液冲洗3次，每次5 min。滴加生物素标记的二抗，37 ℃ 孵育30 min。PBS缓冲溶液冲洗3次，每次5 min。滴加适量的辣根酶标记的链霉素工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS缓冲溶液冲洗3次，每次5 min。DAB显色剂显色、冲洗、复染、脱水、透明、封片[8]，免疫组化图片采用ImageJ软件进行灰度值分析[9]。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 苏黄止咳胶囊对慢阻肺模型大鼠肺功能的影响

表1示，与空白对照组比较，模型对照组PEP、FEV1显著降低(P<0.01)；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组、氨茶碱片组PEP显著升高(P<0.05或0.01)；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组、氨茶碱片组FEV1显著升高(P<0.05或0.01)。

3.2 苏黄止咳胶囊对大鼠慢阻肺模型肺脏HE染色病理分级的影响

表2图1示，与空白对照组比较，模型对照组HE染色病理分级显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组、氨茶碱片组HE染色病理分级显著降低(P<0.05或0.01)。

表2 各组肺脏HE染色病理分级比较

注：A．空白对照组；B．模型对照组；C．苏黄止咳胶囊低剂量组；D．苏黄止咳胶囊中剂量组；E．苏黄止咳胶囊高剂量组；F．氨茶碱片组

3.3 苏黄止咳胶囊对大鼠慢阻肺模型肺脏细胞NF-KB p65、TLR4、IAP1表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组肺脏细胞NF-KB p65、TLR4、IAP1表达均显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组和氨茶碱片组NF-KB p65、TLR4表达均显著降低(P<0.05或0.01)；与模型对照组比较，苏黄止咳胶囊各剂量组和氨茶碱片组IAP1表达均显著降低(P<0.05或0.01)。

表 1 各组肺功能检测结果比较

4 讨论

有研究表明，苏黄止咳胶囊口服可以改善慢阻肺患者的肺功能,提高生存质量,减少慢阻肺患者再入院次数。苏黄止咳胶囊联合噻托溴铵能够有效改善慢阻肺肺功能,减轻患者咳嗽、咳痰等症状,减轻呼吸困难,延缓气道重塑[10]。苏黄止咳胶囊联合噻托溴铵对慢性阻塞性肺疾病稳定期的FEV1、FEV1/FVC、IL-6、IL-8均较前明显改善[11]。在苏黄止咳胶囊联合小剂量茶碱治疗风邪犯肺型慢性阻塞性肺疾病的研究中，苏黄止咳胶囊组咳嗽症状评分显著改善,总有效率高,复发率低[12]。苏黄止咳胶囊具有疏风宣肺的功效，用于肺气失宣所致的咳嗽，或用于气急、遇冷空气、异味、空气污染等因素引起的咳嗽。肺气肿是支气管和肺疾病常见的并发症，与吸烟、空气污染、小气道感染、尘肺等关系密切，慢性阻塞性细支气管炎是引起肺气肿的重要原因。本研究结果表明，苏黄止咳胶囊中剂量组、苏黄止咳胶囊高剂量组可显著增加慢阻肺模型大鼠PEP及FEV1，具有改善慢阻肺模型大鼠肺功能的作用。

TLR受体是参与非特异性免疫的蛋白质分子，TLR如同天然免疫的眼睛，监视与识别各种不同的疾病相关分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障[13]。

机体最强的抗原呈递细胞可表达TLR。借助TLR识别LPS、肽聚糖以及分支杆菌的细胞壁成分等具有PAMP的分子，树突细胞被活化而成熟，提供获得性免疫的共刺激信号，因此TLR是微生物成分引起树突细胞活化的桥梁[14]。NF-κB是一个转录因子蛋白家族，NF-κB通常以p65与 p50组成的异二聚体存在[15]。P65蛋白质二聚化形成具有活性的NF-kB。在未受到刺激的细胞中NF-kB 二聚体通过与细胞质中3个抑制因子结合，以无活性的状态存在[16]。刺激信号可降解IkBs进而活化NF-kB，依赖IKK-降解IkBs的活化途径被称为经典的NF-kB活化途径。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptotic proteins，IAPs)主要通过抑制Caspase3、7、9等酶的活性而发挥阻断凋亡的作用。IAPs 家族成员抑制细胞凋亡功能与NF-kB 的活化诱导信号强度呈正相关[17]。苏黄止咳胶囊中剂量组、苏黄止咳胶囊高剂量组大鼠肺脏TLR4表达显著降低，提示苏黄止咳胶囊可能通过阻断LPS诱导TLR4表达，从而抑制脂多糖引起的炎症反应。HE染色及免疫组化染色结果表明，肺组织炎症反应程度与NF-KB p65表达呈正相关。苏黄止咳胶囊中剂量组、苏黄止咳胶囊高剂量组大鼠肺脏炎症反应级别与NF-KB p65表达均显著降低，说明苏黄止咳胶囊可能通过NF-KB通路调控外界刺激引起肺部的炎症反应。苏黄止咳胶囊各组大鼠肺脏IAP1表达均显著降低，可能与其抑制NF-KB的活化有关。综上所述，苏黄止咳胶囊可能通过改善肺功能，降低慢阻肺模型大鼠肺脏NF-KB p65、IAP1和TLR4的表达，从而减轻慢阻肺模型大鼠肺组织细胞炎症反应，最终起到对慢阻肺模型大鼠肺脏的保护作用。