基于AQP9和线粒体细胞凋亡途径相关性探讨健脾活血祛湿方对体外培养H22肝癌细胞的影响*

李 嘉，高 玲，杨孝芳，张 军，蒲 翔，施杨婉玲

(贵州中医药大学，贵阳 550025)

肝癌是最常见的结缔组织瘤之一，每年在全世界范围有60万新增患者，其恶性程度仅次于胃癌和食道癌，在所有肿瘤相关性死因中排在第三位[1]。中药对减轻肝癌患者的临床症状，提高患者的生存质量和免疫功能、预防复发和转移都具有重要作用[2]。课题组以“毒损肝络”理论为用药的指导依据，自拟健脾活血祛湿方辅助治疗肝癌。前期研究结果显示，本方可显著提高肝硬化腹水大鼠线粒体水通道蛋白8、9(aquaporin8、9，AQP8、9)的表达，减轻线粒体水肿，同时促进线粒体ATP合成，改善肝功能，提高细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)活性表达，促进肝癌细胞在线粒体途径的凋亡[3]。为进一步研究本方在治疗肝癌中可能存在的作用及作用机制，课题组进行体外培养H22肝癌细胞，在不同剂量健脾活血祛湿方的给药干预下，观察细胞的增殖抑制率、凋亡率及线粒体膜电位和AQP9的改变，为中医药治疗肝癌提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株

H22小鼠肝癌细胞，购自中南大学湘雅医学院细胞保存中心。

1.2 实验药物

健脾活血祛湿方组成：五爪龙30 g，白术30 g，白背叶根30 g，猪苓15 g，田基黄20 g，茜草15 g，土鳖虫10 g，砂仁5 g(后下)，全部药材均购自贵阳中医学院第一附属医院药房，符合《中华人民共和国药典》2010年版要求。先加蒸馏水浸泡40 min，一煎加药材量的8倍水，沸腾后煎40 min；二煎加药材量的6倍水，沸腾后煎30 min过滤，2次所得滤液混合后干燥浓缩至15 ml，-20 ℃保存备用。以1 g/m1的原液，80 ℃水浴30 min，连续3 d灭活后，1000rpm离心10 min，-20 ℃保存备用。实验时以含2%DMEM培养液倍比稀释。

1.3 主要试剂

胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基(美国Invitrogen公司)；DMSO(美国Sigma公司)；胰蛋白酶、PBS缓冲液、Trizol(均为Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNAEraser，RR047 A、TBGreen© Premix Ex TaqTMII，RR820 A(均为TAKARA公司)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(均购自广州化学试剂厂)；DEPC(上海生工(GAPDH抗体)(1∶4000稀释液)，杭州三箭公司；AQP9抗体(1∶400稀释液)，博世德公司(批号BA3619-2)；Bax抗体(1∶1000稀释液)，CST公司(批号5023)；Bcl-2抗体(1∶1000稀释液)，CST公司(批号2870)；注射用环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX):200 mg/瓶，德国Baxter Oncology Gmbh 公司。

1.4 仪器

超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；倒置显微镜(美国thermo公司)；低速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；酶标仪(美国thermo公司)；ABI7500荧光定量PCR仪(美国Invitrogen公司)；PCR仪(美国thermo公司)；DYY7C型电泳仪电源(北京市六一仪器厂)；TY-80B脱色摇床(江苏金坛市莱华仪器制造有限公司)；电泳槽(Tanon公司)；湿转转膜仪(Tanon公司)。

2 方法

2.1 细胞培养

从液氮中取出冻存的小鼠H22细胞，置于含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下连续培养孵育，倒置显微镜下观察细胞生长情况并用台盼兰染色，计算细胞存活率达95%以上，取对数生长期细胞，用PBS缓冲液清洗2遍，经胰蛋白酶消化后，加入4 mL DMEM高糖培养基终止胰蛋白酶的消化，充分均匀吹打，使H22细胞处于单个悬浮状态，对H22细胞进行细胞计数。

2.2 比色法(MTT)测定

H22细胞增殖抑制率将药物做系列倍比稀释成高浓度(200 mg/ml)、中浓度(100 mg/ml)、低浓度(50 mg/ml)，同时设置不加任何药物的空白组和CTX组(20 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2条件下分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，标记为A、B、C、D。取对数生长期细胞，将细胞密度调整为3×103/mL，接种在2块96孔板中。96孔板外围孔加入PBS缓冲液0.1 ml/孔，中间60孔每孔加入100μLDMEM高糖培养基，置于37 ℃，5%CO2条件下培养24 h。24 h后取孔板A每孔加入20 μL MTT，继续放于CO2培养箱中培养4 h，弃上清加入DMSO 150 μL，充分振荡溶解结晶，在490 nm波长酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度(A)，计算药物作用24 h细胞增殖抑制率。同理测出48 h、72 h、96 h孔板B、C、D各孔吸光度。增殖抑制率=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。

2.3 Annexin V-FICT/PI检测

H22细胞凋亡率取对数生长期细胞，将细胞密度调整为6×104/mL接种在6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，胰蛋白酶消化细胞，终止消化后离心收集2×104个细胞，双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。每个流式管加入5 μL Annexin V-FICT和10 μL PI，避光静置5 min。通过FICT检测通道(FLI)检测Annexin V-FICT(Ex=488 nm；Em=530 nm)，通过PE检测通道检测PI(FL2)。

2.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测

表1示，H22细胞AQP9的表达细胞加1 ml Trizol提取总RNA，室温放置5 min，加入200 μL氯仿，颠倒混匀后室温放置15 min，4℃ 12000 g离心15 min，吸取上层水相，至另一离心管中，加入0.5 ml异丙醇混匀，室温放置5～10 min，4℃ 12000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底，加入1 ml 75%乙醇，温和振荡离心管，洗涤沉淀，4 ℃ 8000 g离心5 min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5～10 min，加入50 μL DEPC处理过的H2O溶解并测量RNA浓度。从-80 ℃冰箱中取出样品RNA 4 ℃下解冻，然后在 0.2 ml PCR 管中配制反应溶液。

表1 引物设计

反应体系：DNA 模板2 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，dH2O Up to 20 μL。反转录条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5sec4℃。将PCR管置于定量PCR仪中进行反应，反应条件为:95 ℃，30 s；95 ℃，3s；60 ℃，30 s，40 Reps，Melt Curve Stage。使用2^-ΔΔCт计算相对mRNA含量，ΔCт=Cт(目的基因)—Cт(管家基因)GAPDH，ΔCт=ΔCт(各用药组)—ΔCт(空白组)，2^-ΔΔCт表示各用药组目的基因mRNA的含量相对空白组所改变的倍数。

2.5 免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测

H22细胞AQP9、B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X protein, Bax)的表达低温提取蛋白，蛋白定量，加入含2-ME(巯基乙醇，强还原剂)的5×上样缓冲液(1∶50)100 ℃变性5 min，12%的SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，用5%的脱脂奶粉于摇床上封闭1 h。一抗孵育：取出封闭好的PVDF膜，用TBST漂洗，根据目的蛋白分子量大小与内参剪开，放入相应稀释好的一抗中孵育，4 ℃过夜。二抗孵育：第2天回收一抗，PVDF膜用TBST洗5遍，于摇床上进行洗涤，每次5 min。洗涤结束后，开始孵育二抗，二抗稀释比例为1∶6000，摇床上室温孵育50 min。用TBST洗膜5次，每次5 min，预先配好显影液、定影液、ECL发光液，每张膜上加200-300ulECL液进行曝光。

2.6 共聚焦显微镜技术观察

JC-1法检测细胞线粒体膜电位，取制备好的线粒体混悬液使用流式细胞仪按JC-1法检测。取适量JC-1(200×)，按照每50 μL JC-1(200×)加入8 mL超纯水比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1，然后再加入2 mL JC-1染色缓冲液(5×)，混匀后把试剂盒中提供的CCCP(10mM)推荐按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10 μM，处理细胞20 min，共振聚焦显微镜观察。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 MTT法测定H22细胞增殖抑制率

图1示，与空白组比较，CTX组在48 h、72 h和96 h对小鼠H22肝癌细胞的抑瘤率明显升高(P<0.05)；与CTX组比较，健脾活血祛湿方各剂量组的抑瘤率呈时间/剂量依赖性增高(P<0.05)，其中高剂量组在96 h的抑瘤率达最高。

注：与空白组比较：*P<0.05；与CTX组比较：△P<0.05

3.2 Annexin V-FICT/PI检测H22细胞凋亡率

图2示，Q2-UL表达晚期凋亡群体，Q2-UR表达中晚期凋亡群体，Q2-LL表达未凋亡群体，Q2-LR表达早期凋亡群体，图中箭头所指部分区域面积表示整体凋亡率。图2表2示，与空白组比较，CTX组的凋亡率明显增加(P<0.05)；与CTX组比较，健脾活血祛湿方各剂量组凋亡率均明显增加(P<0.05)，其中高剂量组表达显著(P<0.05)。

图2 Annexin V-FITC/PI检测H22肝癌细胞凋亡

表2 Annexin V-FITC/PI检测H22肝癌细胞凋亡比较

3.3 RT-PCR检测H22细胞AQP9的表达

图3示，与空白组比较，CTX组的AQP9mRNA转录水平明显增高(P<0.05)；与CTX组比较，健脾活血祛湿方高剂量组的AQP9mRNA转录水平明显增高(P<0.05)，中、低剂量组的AQP9mRNA转录水平明显下降(P<0.05)，各剂量组呈剂量依赖性增高(P<0.05)。

注：与空白组比较：*P<0.05；与CTX组比较：△P<0.05

3.4 WB法检测H22细胞AQP9、Bax、Bcl-2的表达

图4、5示，与空白组比较，CTX组的AQP9、Bax、Bcl-2蛋白表达水平均有显著增高(P<0.05)；与CTX组比较，健脾活血祛湿方各组AQP9、Bax蛋白表达水平呈剂量依赖性增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达呈剂量依赖性下降(P<0.05)。

注：A.空白组; B.CTX组;C.低剂量组; D.中剂量组;E.高剂量组

注：与空白组比较：*P<0.05；与CTX组比较：△P<0.05

3.5 共聚焦显微镜观察

JC-1法检测细胞线粒体膜电位：红色荧光表示细胞线粒体膜电位较高，绿色荧光表示细胞线粒体膜电位较低。图6示，空白组Merge无明显绿色荧光细胞显示，以红色荧光为主要表达(箭头所示)；与空白组比较，CTX组Merge显示绿色荧光增多(箭头所示)，提示线粒体膜电位有明显降低；与CTX组比较，健脾活血祛湿方低、中剂量组Merge显示绿色荧光变浅(箭头所示)，高剂量组Merge主要表达绿色荧光且渐强(箭头所示)，提示健脾活血祛湿方可显著降低线粒体膜电位，促进细胞凋亡。

图6 共聚焦显微镜观察JC-1检测细胞线粒体膜电位(DAB×200)

4 讨论

肝癌属于中医学“肝积”“积聚”“癥瘕”等范畴，一般认为由于情志不畅、饮食劳倦、寒邪侵袭以及久病不愈、耗气伤血等因素影响脏腑气机异常变化，络脉郁滞不通、津血互换失常、痰湿血瘀凝滞脉络而终成本病[4]。肝癌属于本虚标实之证。络病学认为“毒损肝络”是肝癌形成的基本病理过程，其基础理论认为毒瘀作祟阻滞于肝络出现络虚、毒侵，而化毒为害则是络病迁延和深化的关键所在，此时的疾病处于正虚邪实、病势胶着状态。课题组根据此理论以健脾活血祛湿方辅助治疗肝癌。本方以五爪龙、白术为君，共奏健脾益气、补益肝络、化湿行水之功；以田基黄、猪苓、白背叶根三药为臣，以达健脾通络、清热利水之效；土鳖虫、茜根活血化瘀、通络为佐，砂仁调理脾胃、辛温化湿为使，达到利湿而不伤脾胃之效。全方配伍严谨，药味精炼，共奏健脾、通络、祛湿之功。现代药理学实验证实，五爪龙具有良好的抗病毒、抑制肿瘤、免疫调节等作用；白术具有良好的保肝利胆作用，常用于治疗肝硬化腹水、消癥积；白背叶根具有良好的保肝利胆、抗纤维化作用；田基黄具有保肝护肝、抗病毒、增强免疫等作用；猪苓、茜根同样具有良好的保肝护肝作用。课题组前期研究结果表明, 健脾活血祛湿方能缓解肝细胞线粒体损伤，改善肝线粒体代谢功能，并具有良好的保肝作用。课题组推测其机制可能是通过激发线粒体细胞凋亡途径，促进肝脏坏损细胞的早期凋亡。同时本研究结果也提示，健脾活血祛湿方各剂量组可呈时间/剂量依赖性地抑制肿瘤细胞生长。

AQP是一种广泛存在于细胞膜上的水通透性蛋白，是近年在肿瘤分子生物学领域内研究的一个热点。目前共发现有13个成员(命名为AQP0-12)，主要介导肝癌细胞凋亡时水的内外膜运动。肝细胞上有多种AQPs且每种表达数量各异，其中AQP9是最重要的一种[5]。一些水通道蛋白在肿瘤中异常表达，并参与肿瘤的凋亡、增殖、侵袭及转移[6]。研究证实，AQP9表达于正常肝脏，在肝癌细胞中表达下降，使得肝癌细胞对渗透压反应和对凋亡的刺激性下降，从而促进肿瘤细胞增殖[7]；AQP9在肝脏肿瘤细胞中比正常肝细胞表达显著减少，离体肝脏肿瘤细胞质膜的水通透性极低，对凋亡诱导信号反应迟钝，而正常肝细胞反应迅速。本研究表明，健脾活血祛湿方各剂量组的AQP9表达均呈剂量依赖性升高，课题组推测肝癌细胞凋亡可能是因为高表达的AQP9增加了肝癌细胞的通透性，促进细胞内外水代谢的运转，线粒体基质的渗透压升高，激活相关凋亡因子，引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)，最终导致细胞核皱缩，核染色凝缩和核碎裂等现象。同时Annexin V-FICT/PI结果也提示，健脾活血祛湿方可呈剂量依赖性地促进细胞凋亡。

线粒体释放凋亡酶激活因子诱导Caspase家族产生级联反应，导致癌细胞的不可逆凋亡，这一过程在肝癌细胞凋亡的发生发展过程中发挥着重要作用[8]。线粒体细胞凋亡途径是三大经典凋亡途径的中心途径，以线粒体膜电位下降为标志，引起相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2与一些通道蛋白PTP、AQP等变位，形成调亡小体导致凋亡。具体途径可表现为细胞受外界因素损伤刺激引起线粒体膜电位下降，ATP合成降低，胞质Ca2+升高以及细胞内活性氧种类(reactive oxygenspecies, ROS)的增加，使腺苷酸转运体(adenine nucleotide tranporter, ANT)的构象改变，进而导致PT孔开放。继而ATm及内膜腺苷转位酶(APH)崩解，呼吸链解偶联，线粒体基质的渗透压升高、内膜肿胀，膜内外形成渗透梯度，水通道蛋白迅速有选择性地将水排出，使细胞凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease, AVD)[9-10]，导致细胞水分丢失。同时伴随线粒体膜间隙的细胞色素c(cytochrome c, Cyt-C)、Smac/DIABLO、细胞凋亡诱导因子(apoptosis induced factor, AIF)、核酸内切酶G(endonucleaseG, EndoG)、Bcl-2蛋白家族等的释放，通过caspase级联反应引起细胞凋亡[11]。本研究发现，健脾活血祛湿方高剂量组细胞线粒体膜电位有下降并出现核皱缩，细胞呈现凋亡趋势；同时Western Blot检测结果也提示，健脾活血祛湿方促进AQP9、Bax表达增高、Bcl-2表达降低，增加促凋亡Bax与抗凋亡Bcl-2比值；Annexin V-FICT/PI结果也提示，健脾活血祛湿方可呈剂量依赖性地增高肝癌细胞凋亡率。

随着对AQP9的进一步研究，尤其针对其在正常肝细胞和肝癌细胞的显著差异表达，课题组自拟健脾活血祛湿方以研究该方基于AQP9促肝癌细胞凋亡的可能性。实验结果均提示，健脾活血祛湿方能够通过线粒体依赖途径触发肝癌细胞凋亡，这可能与AQP9具有一定相关性，但是否直接调控AQP9表达还需后续实验的深入研究。