腊梅叶醇提物二氯甲烷部位对阿尔茨海默病小鼠的影响*
2021-03-31郭佳晨袁青青丁永芳刘晓龙钱海兵
郭佳晨，袁青青，丁永芳，陈 铭，刘晓龙，钱海兵△
(1. 贵州中医药大学，贵阳 550025； 2. 成都中医药大学，成都 611137)
阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)是一种表现出具有进行性特征的神经减退性疾病，该病最初发病征象不明显，病程呈慢性进行性，临床主要以记忆和认知功能障碍、语言和行为能力缺失为主要特征。研究认为，其发病与脑内产生Aβ的大量沉积[1]、机体抗氧化能力及抗炎能力减弱[2]、中枢胆碱能系统的异常[3]以及脑血流量的流速降低[4]等均有密切关系。
山腊梅(Chimonanthusnitens(Linn.)Link)是腊梅科腊梅属落叶灌木。腊梅叶醇提物二氯甲烷部位是用乙醇从腊梅叶中提取得到腊梅叶醇提物后，再用二氯甲烷提取所得到的一种物质，极性相对较小且具有小分子的特征，在一定程度上可通过血脑屏障[5-7]。基于本课题组前期研究结果[8]，本实验以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)、乙酰转移酶(acetyltransferase，ChAT)为切入点，探讨腊梅叶醇提物二氯甲烷部位对阿尔茨海默症的影响，进而阐明其相关的作用机制，为腊梅叶深度开发和研发具有自主知识产权的治疗阿尔茨海默症新药提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 实验动物
SPF级KM小鼠雌雄各半，体质量25～35 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物合格证书编号SCXK(渝)2012-0001。本实验已通过贵州中医药大学实验动物伦理委员会审查。
1.2 试剂
D-半乳糖(北京索莱宝科技有限公司，批号0637)；腊梅叶醇提物二氯甲烷部位(自提)；氢溴酸东莨菪碱注射液(逐成药业股份有限公司，批号H41021048)；吡拉西坦(杭州民生药业有限公司，批号T18F007)；SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20181220)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20181226)；BCA法蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号 A045-3-2)；AChE测试盒(南京建成生物工程研究所，货号A105-1-1)；ChAT试剂盒(组织)(南京建成生物工程研究所，货号A079-1-1)。
1.3 仪器
Morris水迷宫(长沙斯泰林生物科技有限公司)；恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；电热恒温箱(典锐化玻实验仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(杭州科晓化工仪器设备有限公司)；电动匀浆机(德国IKA)；微量移液器(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。
2 方法
2.1 供试品的制备
将采集来的腊梅叶阴干打成粗粉，取其粉末3600 g放入桶中，用75%的酒精将其浸没，将桶盖盖好并用保鲜膜封好，将其浸泡12 h。取浸泡好的药材粉末放入圆底烧瓶中，加粉末重量3倍的75%酒精(总体积不超过圆底烧瓶体积的1/2),将调温电热套温度调至78～80 ℃之间，加热至微沸开始计时，热回流提取2 h过滤。将剩余滤渣再加3倍量的酒精，热回流1 h 2次。将3次过滤所得的滤液放入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，分离酒精与药液减压浓缩。用二氯甲烷萃取，将二氯甲烷层的萃取液放入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，回收二氯甲烷减压浓缩。将浓缩后的药液于蒸发皿中蒸干，最后的浸膏量为103.6 g，得膏率为2.9%。给药时用蒸馏水配置相应的浓度。
2.2 动物造模、分组及给药
实验开始前适应性饲养小鼠7 d。将108只KM小鼠按随机数字表法分为(雌雄各半)空白对照组、模型对照组、阳性药吡拉西坦(600 mg/kg)对照组、腊梅叶醇提物二氯甲烷部位高、中、低(350、175、87.5 mg/kg)剂量组6组各18只。除空白对照组注射等量生理盐水外，其余各组均颈部皮下注射D-半乳糖[9](140 mg/kg)，连续4周，从第3周开始增加腹腔注射东莨菪碱(2 mg/kg)，连续2周。造模完成后开始给药，其中腊梅叶醇提物二氯甲烷部位各组及阳性对照组开始灌胃给药4周，每日1次，正常组和模型组每日根据体质量灌胃相应体积的蒸馏水。
2.3 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力
给药4周后，每天4次将小鼠进行定位航行实验，实验用时6 d。空间探索实验室在定位航行实验基础上，于第7天将平台取出水迷宫，将小鼠随机从象限的中心点放入水中，记录小鼠120 s内穿过原先放置平台位置的次数，从而判定小鼠的记忆能力，完成水迷宫实验。
2.4 检测标本的制备
水迷宫实验后，每组随机抽取10只小鼠，采取摘除眼球取血，取血前先麻醉小鼠，操作符合动物福利的相关要求。取血后将装有血液的试管放入离心机制备血清；在冰浴条件下将小鼠大脑中的海马组织放入5 ℃水温的生理盐水中缓慢漂洗，后用滤纸吸干表面水分，称取海马组织的重量，按重量体积1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，机械匀浆需在冰水浴的条件下进行，2500 r/min，离心约10 min，吸取其上清液备用,同法提取肝组织匀浆液。
2.4.1 匀浆蛋白含量的测定 将双蒸水、待测样品、标准品以及工作液按规定放入空白孔、标准孔、测定孔中，严格按照BCA法蛋白定量试剂盒说明书，用紫外可见分光光度计测定各管吸光度值，测定海马区脑组织匀浆和肝组织匀浆的蛋白含量。计算公式：总蛋白浓度(μg/ml)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(563μg/ml)×样本测定前稀释倍数。
2.4.2 SOD、MDA的测定 取AD小鼠的脑组织及肝组织的匀浆液及血清，将待测样本、双蒸水、酶工作液、酶稀释液以及底物应用液按规定加入对照孔、对照空白孔、测定孔以及测定空白孔中，严格按照试剂盒说明书用紫外可见分光光度计测定各管吸光度值，计算出小鼠脑组织、肝组织、血清中SOD的活力以及MDA 的含量。计算公式：(1)组织SOD活性(U/mgprot)=(对照OD值-测定OD值)/对照OD值÷50% ×(反应液总体积/取样量
2.4.3 AChE、ChAT的测定 取AD小鼠的脑组织及肝组织的匀浆上清液，将试剂盒中的各个试剂、蒸馏水以及组织匀浆上清液按规定加入测定管中，严格按照试剂盒说明书用紫外可见分光光度计测定各管吸光度值，测量和计算出组织匀浆AChE和ChAT活性。计算公式：(1)组织匀浆AChE活性(U/mgprot)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(1umol/ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml);(2)组织匀浆ChAT活性(U/g组织湿重)=(测定OD值-对照OD值)/(反应时间<20 min>×1.98×10-2)×反应总体积(600ul)/取样量(25ul)÷5%匀浆液浓度(g组织湿重/ml)。
2.5 统计学方法
3 结果
3.1 腊梅叶醇提物二氯甲烷部位对AD小鼠行为的影响
表1示，在小鼠在造模后模型动物的逃避潜伏期明显比空白组用时明显延长，穿过平台次数明显比空白组少，差异有统计学意义(P<0.05)，说明模型动物学习能力下降，造模成功。对模型动物分组给药，在最后1次给药结束后再次检测。阳性药组及给药组的逃避潜伏期均有所缩短，穿过平台次数均有所增加，说明阳性药组及腊梅叶醇提物二氯甲烷部位组模型动物学习记忆能力改善，均取得了疗效，其中给药组高剂量组表现明显(P<0.05)，说明在本实验现有条件下，给药组高剂量对改善AD小鼠学习、记忆及认知能力疗效显著。
表1 造模完成后及给药结束后小鼠逃避潜伏期及穿过原平台次数比较
3.2 腊梅叶醇提物二氯甲烷部位对AD小鼠SOD、MDA的影响
表2示，实验小鼠脑组织SOD含量空白组最高，模型组最低，且差异有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功；低剂量组、阳性药组与模型组比较，SOD含量活性升高，其中给药组、高剂量组效果最好(P<0.05)。各组小鼠脑组织MDA的含量与空白组比较，模型组明显升高(P<0.05)。
表2 小鼠脑组织、肝组织、血清SOD、MDA数值比较
3.3 腊梅叶醇提物二氯甲烷部位对AD小鼠ChAT、ACHE的影响
表3示，与空白组比较，模型组AChE含量升高(P<0.05)；腊梅叶醇提物二氯甲烷部位低剂量组及阳性药组与模型组比较，AChE含量降低，其中给药组高剂量组效果最好(P<0.05)。与空白组比较，模型组小鼠脑组织ChAT含量明显降低(P<0.05)；腊梅叶醇提物二氯甲烷部位低剂量组、阳性药组与模型组比较，ChAT含量升高，其中给药组高剂量组效果最好(P<0.05)。
表3 小鼠脑组织AChE、ChAT数值比较
4 讨论
目前对于AD的临床西药治疗主要包括抑制Aβ形成和沉积的药物、胆碱能类药、雌激素类药物、促进脑代谢药物等[10]，虽然在临床运用也取得了一定的疗效,但总体效果不太理想。近年来，中医药治疗老年痴呆的临床应用及科研方面已取得不少成果，但绝大部分相关研究仍停留在对AD的基础研究阶段，对治疗AD的作用机制仍不肯定，选取的中药常为临床大量应用于痴呆疾病的经验方。因此，明确AD的发病机制，同时找到抑制AD的新药及其有效成分具有重要的理论及临床研究价值。
早期对腊梅叶的药理研究主要集中于挥发油及生物碱的药理作用。前期研究发现，腊梅叶醇提物对痴呆小鼠具有一定作用，而其醇提物二氯甲烷部位在治疗脑部疾病方面的研究较少[7]。因此，本研究将结合前期研究结果，在进行腊梅叶醇提物化学萃取的基础上，进行腊梅叶醇提物二氯甲烷部位的抗AD研究。
SOD是体内消减自由基的一种主要起效酶类，其起效机理主要是催化生物氧化产生超氧自由基，消除并抑制自由基的连锁反应过程，其与AD的形成密切相关。而MDA是自由基对生物细胞膜损伤的主要代谢产物，可让生物膜产生变性及坏死，影响DNA的正常运转，同时使机体内SOD活性降低，使自由基不断地产生连锁反应造成恶性循环，并最终引起AD等众多老年病的发生[11]。AD的严重程度与胆碱能系统功能的损害程度密切相关，ChAT是乙酰胆碱的合成酶,可催化机体有关辅酶生成乙酰胆碱。ChAT的活性变化可间接反映乙酰胆碱在脑部组织中的合成水平;与ChAT不同,AChE是乙酰胆碱的分解酶,AChE的活性变化可间接表现出乙酰胆碱在脑部组织中的分解水平；ChAT和AChE共同维持着脑部组织中乙酰胆碱水平的相对平衡,体现了乙酰胆碱的代谢水平，水平低下则可导致学习及记忆障碍[12]。
本实验表明，皮下大剂量注射D-半乳糖联合东莨菪碱腹腔注射后，小鼠表现为学习记忆能力下降，脑组织匀浆中SOD活性降低，而MDA活性升高，可以认为成功诱导出AD症状。给予腊梅叶醇提物二氯甲烷部位后，小鼠的逃避潜伏期及穿过原平台次数有显著升高，说明其对改善AD小鼠的学习、记忆及认知能力具有明显效果，且能减轻氧化损伤，亦可提高小鼠脑组织、肝组织、血清的SOD，降低MDA活性。
乙酰胆碱是机体中枢胆碱能神经系统中保持高级神经系统功能的一种重要物质。研究认为[13]，中枢胆碱能神经系统与机体的学习、记忆及认知紧密相关，AChE的作用是在机体内分解乙酰胆碱,在机体脑组织内的分布范围很广,与学习记忆功能紧紧相关，活性升高则会导致AD的产生并反映AD程度。而ChAT是合成乙酰胆碱的一种关键酶,主要存在于胆碱能神经元内,在细胞体内合成是衡量胆碱能神经元功能正常与否的重要标志[13]。本实验表明，腊梅叶醇提物二氯甲烷部位可提高小鼠脑组织ChAT活性，降低AChE活性，从而改善小鼠的AD。
本实验结果为腊梅叶醇提物二氯甲烷部位能改善AD小鼠的学习、记忆及认知能力，在一定程度具有抗AD的作用。其机制可能与提高小鼠脑组织、肝组织、血清的SOD，降低MDA的活性，提高小鼠脑组织ChAT的活性，降低AChE的活性有关，该研究结果为腊梅叶的深入研究提供了一定的实验基础与理论依据。
