葱白提取物对心梗后心衰大鼠心室重构及细胞凋亡的影响*

谢婷婷，邢若丹，顾歆韵，付 聪，马 威，杨文强，余 浩，田立群，吴勇宏，柯于鹤△

(1. 湖北中医药大学， 武汉 430065； 2. 武汉市第一医院， 武汉 430022； 3. 武汉市第一医院神农架林区中医院，湖北 神农架 442421)

目前，我国心血管病(CVD)患病人数仍快速增长，CVD患病率及死亡率上升，心衰(HF)作为临床最常见的心血管疾病之一，其发病率亦不断增长。急性心肌梗死(AMI)是临床冠状动脉疾病中最常见造成HF的原因之一[1]。研究报道显示，尽管心梗后心衰的发生率有所减少，但HF诊断后5年生存率仍较低而死亡率较高[2]，故如何改善HF患者预后及延长其寿命仍是亟待解决的问题。

近年诸多研究表明，中药可通过多种途径延缓HF发展进程，明显改善患者生活质量。本课题组前期研究证实，葱白提取物具有改善心肌缺血、抗氧化、调脂、改善心肌纤维化等作用[3-5]。细胞凋亡参与HF的心室重构是HF重要机制之一。本实验旨在探究葱白提取物对于心梗后心衰大鼠心室重构及细胞凋亡的影响及其作用通路。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠65只，体质量(200±10 g)，由湖北省实验动物中心提供，合格证号42000600027433、42000600026538，饲养于武汉市第一医院SPF级动物实验室，动物号SYXK(鄂)2014-0030。本研究已通过武汉市第一医院实验动物福利伦理委员会审查。

1.2 药物

原料为神农架林区天葱葱白，葱白提取物由武汉市第一医院盘龙制剂中心提取，提取过程简述如下：葱白经过冷冻干燥和超临界CO2萃取，溶于吐温- 80配成 0.07% 的混合液，制取后4 ℃保存。培哚普利(8 mg/片，天津制药厂)碾碎后溶于蒸馏水，蒸馏制成0.07%的混合液。

1.3 试剂与仪器

免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；大鼠B型脑钠肽(BNP)试纸(Elabscience公司)。DW300-B型小型动物呼吸机(淮北正华有限公司)；ABI QuantStudio 6型实时荧光定量PCR仪等。

1.4 造模、分组及给药

参照心衰动物模型建模[6]，取65只大鼠进行左冠状动脉结扎，取9只大鼠仅于同位置穿线不结扎，术后所有大鼠注射等量青霉素，饲养1周后将结扎并存活的大鼠随机分成模型组、葱白提取物组(后文简称葱白组)和对照组，其中葱白组又分为高、中、低剂量组，未结扎大鼠为假手术组，每组均为9只(造模过程中大鼠共存活54只，死亡11只，死亡率16.9%，其中假手术组无死亡，与文献报道相符[6])。葱白组以相应剂量葱白提取物灌胃，对照组以培哚普利相应剂量灌胃，假手术组、模型组以等量0.9%氯化钠溶液灌胃。以上药物给药剂量根据人临床用药剂量，参照人与动物用药剂量换算标准[7]，给予相应药物灌胃给药12周。

1.5 标本采集

给药12周后将大鼠禁食不禁水过夜，分别称重，以0.3 kg/ml 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采腹主动脉血6 ml，经3000 r/min离心10 min，分离血清以备检测。迅速开胸取出心脏，用生理盐水清洗后用滤纸吸干，取0.5 cm厚的心尖部组织于5%多聚甲醛中固定避光保存以备染色，取剩余新鲜左心室组织存于-80 ℃冰箱，用于Western blot 等检测。

1.6 检测指标

1.6.1 苦味酸-天狼星红染色 取制备好的左心室组织切片若干，用二甲苯脱蜡至水，置于0.1%苦味酸天狼星红染液浸泡1 h，Harris's苏木素复染5 min，乙醇脱水，二甲苯固定，中性树胶封片风干。在显微镜下观察心肌细胞的形态学变化，每组取2块切片，每块切片记录3个高倍镜视野(×400)。

1.6.2 血清BNP含量测定 ELISA测定大鼠血清BNP含量，参照试剂盒说明书。

1.6.3 RT-qPCR检测Caspase-3 mRNA表达 取各组新鲜冰冻大鼠心肌组织100 mg加入1 ml Trizol试剂研磨成浆，移至无RNase的1.5 ml EP管中裂解、离心，按照试剂盒操作步骤进行RNA提取，将稀释的RNA样本反转录合成cDNA，依次加入Oligo (dT) 18 (10 μM) 2 μL、dNTP (2.5mM) 4 μL、5×Hiscript Buffer 4 μL、Hiscript Reverse Transcriptase 1 μL、Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL、样本RNA4.96326 μg，加入ddH2O (Rnase free)混合至20 μL，25 ℃条件下孵育5 min，50 ℃ 孵育15 min，85 ℃孵育5 min，4℃孵育 10 min，将稀释至10倍的cDNA进行qPCR扩增，以Rat GAPDH为内参，反应条件为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 1 min，退火50℃ 30 sec，延伸60℃ 30 sec，循环40次。最终数据以目的片段/内参Rat GAPDH片段条带灰度值比值的半定量比较。Caspase-3上游引物序列：5′- TGGACTGCGGTATTGAGACA -，下游引物序列：5′- GCGCAAAGTGACTGGATGAA -3’。

1.6.4 Western Blot检测Caspase-3、p65、Bcl-2、Bax蛋白的表达 取新鲜左心室组织裂解，提取其总蛋白，灌胶上样进行电泳、转膜，经免疫反应后采用ECR化学发光法检测显色条带强弱。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0进行统计分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，两独立样本采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏组织病理学结果

天狼星红染色显示，假手术组心肌细胞排列整齐，细胞结构清晰可辨，多数细胞核间距相差不多，整体着色较浅，鲜见红染的纤维组织；模型组排列紊乱，细胞结构破坏较重，细胞核间距大小不一，整体着色较深，多数心肌细胞坏死区可见大量红染纤维组织；由此图1可以看出，一定程度上葱白提取物、培哚普利均可改善心肌纤维化。

注：A.假手术组； B.模型组； C.高剂量组； D.中剂量组； E.低剂量组； F.对照组，奥林巴斯BX53型生物显微镜(×400)

2.2 血清BNP含量

表1示，与假手术组比较，模型组BNP(>100pg/ml)显著增高(P<0.01)；与模型组比较，对照组、葱白组BNP含量均显著降低(P<0.01)，尤以高剂量组降低最为明显。结果提示，心梗后心衰模型成功；葱白提取物和培哚普利均能降低大鼠BNP含量，且葱白提取物降低大鼠血清BNP的效用呈剂量相关性，高剂量较中、低剂量效果好。

2.3 Caspase-3 mRNA的表达结果

表1示，与假手术组比较，模型组细胞凋亡水平增加，Caspase-3 mRNA表达增加(P<0.05)；与模型组比较，葱白组和对照组Caspase-3 mRNA表达下降(P<0.01)；与对照组比较，低、中剂量组Caspase-3 mRNA表达增加(P<0.01)，高剂量组Caspase-3 mRNA表达降低(P<0.01)。

表1 各组大鼠血清BNP含量及心肌组织Caspase-3 mRNA表达水平比较

2.4 Western Blot 检测Caspase-3、Bax、Bcl-2、p65蛋白的表达结果

表2图2示，Caspase3、Bax蛋白表达水平各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；bcl-2蛋白表达与假手术组比较，模型组升高(P<0.05)；与模型组比较，葱白组均降低(P<0.05)；p65蛋白表达与假手术组比较，模型组升高(P<0.05)；与模型组比较，葱白组、对照组均下降(P<0.05)；与对照组比较，葱白高剂量组降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、p65分别于内参灰度值比值比较

3 讨论

AMI属于中医学“胸痹心痛”范畴，用葱白治疗“胸痹”早有记载。明·李时珍《本草纲目》记载：“卒心急痛，牙关紧闭欲绝，以老葱白五茎去皮须，捣膏，以匙送入咽中，灌以麻油四两，但得下咽即苏。[8]”AMI是临床冠状动脉疾病中最常见造成HF的原因之一。葱白相关现代研究及前期临床实验研究表明，葱白提取物具有改善心肌缺血、抗氧化、调脂、改善心肌纤维化等作用，临床防治心梗后心衰疗效较好[3-5]。

BNP是HF诊断、临床事件风险评估、预后评估的重要指标，还可用于评价HF治疗效果。心室重构是HF重要机制之一，是由多种复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型变化，包括病理性心肌细胞肥大、心肌细胞的凋亡与坏死、细胞外基质过度沉积或降解增加。心肌细胞凋亡是心梗后心衰心脏重构的重要机制之一，故抑制心肌细胞凋亡可以减轻心脏重构，改善心功能。

注： A.假手术组； B.模型组； C.高剂量组 D：中剂量组 E：低剂量组 F：对照组

细胞凋亡途径之一是细胞外的死亡受体途径，主要靠刺激因素激活p53、Bcl-2、NF-κB等基因，由肿瘤坏死因子 (TNF) 家族受体介导激活Casepase-8。随后通过介导不同的级联信号，激活效应性Caspase-3(Caspase-3是凋亡级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶)，进一步激活内切核酸酶，促使DNA链断裂，细胞结构最终解体，完成整个细胞凋亡的过程。NF-κB还能影响促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，调控Bcl-2和Bax的比值，以达到抑制心肌细胞凋亡的作用。NF-κB以p65和p50组成的异源二聚体形式最为常见[9-11]。

实验结果表明，葱白提取物在一定程度上可以改善心梗后心衰的心肌纤维化表现以逆转心室重构，降低血清BNP水平以改善HF预后，降低Caspase-3 mRNA、bcl2蛋白和p65蛋白表达，以抑制细胞凋亡。结合实验结果及相关文献，葱白提取物抑制细胞凋亡的机制可能与NF-κB信号通路有关。通过抑制bcl2、p65蛋白的表达，结合Caspase-3、Caspase-7，阻止Caspase-9的活化，起到抗细胞凋亡的作用。HF重要机制之一是心室重构，而细胞凋亡是心室重构的重要机制之一，故抑制细胞凋亡、延缓心肌细胞衰老、逆转心室重构可以改善心脏功能及远期预后，对临床诊治心力衰竭具有重要临床意义。

综上所述，葱白提取物可以在一定程度上抑制心肌细胞凋亡，逆转心室重构，延缓心衰进展，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。