西加云杉木材中单宁的提取、分布及组分

2021-03-31郑欣欣赵雨婷潘彪王新洲

林业工程学报 2021年2期

郑欣欣，赵雨婷，潘彪,2*，王新洲,2

(1.南京林业大学材料科学与工程学院，南京 210037；2.南京林业大学林业资源高效加工利用协同创新中心，南京 210037)

植物单宁是一类高分子量水溶性多酚类化合物的总称，又称植物鞣质、植物多酚，广泛分布于树木的皮、根、叶、壳、木材和果肉中[1]。目前关于植物单宁的提取方法主要为有机溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和酶转化提取法等，其中有机溶剂萃取法最为常用。木材内植物单宁的分布不仅与树种有关，还与树木的部位有关，如木材的心材和边材、树干的不同高度、主干和枝桠之间单宁含量均存在较大差异[2]，目前木材酚类物质的株内变异规律尚无定论。近年来，对植物单宁化学结构的研究已成为国内外相关研究的热点，根据化学结构的不同，植物单宁通常分为水解单宁(棓酸酯类多酚)和缩合单宁(聚黄烷醇类多酚或原花色素)两大类。由于水解单宁分布较窄且难以纯化，故关于植物单宁组分构成的解析主要在缩合单宁[3]。Callemien等[4]通过高效液相色谱-电喷雾电离(-)串联质谱[NP-HPLC-ESI(-)-MS/MS]分析发现，在啤酒花的丙酮/水提取物缩合单宁的成分中存在(+)儿茶素、(-)表儿茶素、原花青素二聚体和原翠雀定。旷慧等[5]采用高效液相色谱测试发现，红树莓提取物中含有原花青素B2。据统计，在木材加工工业中，单宁引起变色约占木材变色的70%[6]。高建民等[7]发现三角枫木材中多元酚类物质以及无色花色素和单宁等在干燥时高温氧化产生变色。曹惠敏等[8]研究麻栎板材变色发现，木材中的多酚类物质的酚羟基和芳香环取代基与铁离子络合反应是其变色的主要原因。在桦木、栎木、樱桃木等单宁含量较高的木材加工过程中，经常会产生蓝黑色鞣酸铁沉淀使木材变色。

西加云杉(Piceasitchensis)为松科云杉属常绿乔木，是世界上优质的乐器共鸣板用材，其材质洁白细腻，纹理通直，但在加工过程中木材中的单宁极易与金属离子发生络合反应致使木材变色，严重影响其作为乐器共鸣板用材的产品等级和商业价值。通过对西加云杉木材内植物单宁的提取，及在树干纵向和径向的分布规律以及组分构成进行研究，以期在加工过程中有针对性地对木材进行变色防治处理，提高用材等级及产品质量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西加云杉试材于2018年3月取自江苏镇江中林新民洲港川雅木业有限公司，购自美国阿拉斯加。随机选取2株，在树干距地面高4和8 m处截取厚度为5 cm的2个圆盘，共计4个圆盘，分别编号A-上、A-下、B-上和B-下。取过髓心径向5 cm木条，按年轮取样，共7个取样点。具体取样年轮数如表1所示。

表1 圆盘取样年轮数Table 1 Numbers of annual rings

香草醛(纯度99%)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D101大孔树脂，购自安徽三星树脂科技有限公司；没食子酸(纯度≥98%，高效液相色谱级，下同。CAS号：149-91-7)、儿茶素(CAS号：154-23-4)、表儿茶素(CAS号：490-46-0)、原花青素B2(CAS号：29106-49-8)、表儿茶素没食子酸酯(CAS号：1257-08-5)，购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司。

Buchi R-200型旋转蒸发仪(德国Buchi)、3-30KS型高速离心机(德国Sigma)、Lambda 950型紫外/可见/近红外分光光度计(美国Perkinelmer)、SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、Alliance E2695 高效液相色谱仪(美国Waters)。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法

取质量恒定后的西加云杉试材，粉碎；称取一定质量的西加云杉试材粉末过60～80目(孔径0.178～0.250 mm)筛后置于三口烧瓶中；加入提取溶剂，在一定温度水浴下回流一定时间；提取液抽滤后40 ℃减压蒸发，4 000 r/min离心10 min，取上清液。另取木粉按照国标GB/T 1931—2009《木材含水率测定方法》测定木材含水率。

提取溶剂的选择：分别选用水、50%甲醇(体积分数)、50%乙醇(体积分数)和50%丙酮(体积分数)对试样进行抽提。溶剂体积分数的选择：分别选用30%，50%，70%和90%(体积分数)的乙醇溶液对试样进行抽提。提取时间的选择：分别选取1，2，4和8 h对试样进行抽提。提取温度的选择：分别选取30，50，70和90 ℃对试样进行抽提。料液比(g∶mL)的影响：分别选取1∶10，1∶15，1∶20和1∶25共4种料液比对试样进行抽提。提取次数的影响：在抽滤所得滤渣中按相同料液比再次加入同种溶剂进行多次提取，保存所得滤液，共重复4次，对试样进行抽提。在以上单因素试验的基础上，选择试剂体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和料液比(D)4个考察因素，每个因素设定3个水平，进行L9(34)正交试验，以确定最佳的提取条件。

1.2.2 单宁含量测定方法

采用香草醛-盐酸紫外分光光度法[9-10]进行单宁含量测定。

1.2.3 定性鉴定试验

用铁矾、溴水、醋酸铅-醋酸和香草醛-盐酸试剂对西加云杉木材内单宁进行类别鉴定。

1.2.4 单宁组分分析

将西加云杉抽提液采用柱层析法分离纯化，洗脱液待测，采用外标法测定各成分含量。将没食子酸、原花青素B2、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯标准品用甲醇分别稀释至0.025，0.050，0.100，0.200和0.400 mg/mL，作标准曲线，确定线性范围，并做精密度和回收率试验。色谱条件[11]：色谱柱Hypersil Green PAH (孔径和长度分别为4.6 和250 mm，填料孔径5 μm)，波长278 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL，运行时间29 min，流速1.2 mL/min。

2 结果与分析

2.1 最佳提取条件的确定

2.1.1 提取溶剂的选择

不同溶剂对西加云杉中单宁的提取量差异较大，50%(体积分数)乙醇溶液为溶剂的提取效果最好，50%丙酮次之，水的提取效果最差(图1a)。一般情况下以棓酸酯多酚(即水解单宁)为主体的酚类可采用丙酮-水体系，以缩合单宁为主体的样品可采用弱酸性醇-水体系，使以共价键与植物组织分子相的单宁降解，能够更好地溶出[12]。考虑到提取效果、成本及对环境的影响，确定乙醇溶液为最佳溶剂。

2.1.2 溶剂体积分数的影响

随着乙醇体积分数的增加，单宁提取量先呈上升趋势，在乙醇体积分数为70%时达最高，此时提取量为5.696 5 mg/g，之后呈下降趋势(图1b)。由于有机溶剂是多酚-蛋白质结合反应有效的抑制剂，随着乙醇体积分数的增大，单宁-蛋白质的连接键逐步被打开，单宁游离出来，使得单宁的溶解度增大，并在70%时达到最高。但随后溶剂中的水分开始减少，溶液的通透性变差，造成了单宁提取率的降低[13]。故乙醇体积分数选取为70%为宜。

2.1.3 提取时间的影响

随着提取时间的延长，单宁的提取量先呈上升趋势，在4 h时达到最高，此时单宁提取量为7.182 0 mg/g，在此之后反而呈下降趋势(图1c)。随着时间的延长，单宁的酚羟基经氧化反应变成酮基，导致在含量测定时部分单宁物质无法显色，从而测得的提取量降低[14]。考虑时间成本，提取时间选取2 h为宜。

2.1.4 提取温度的影响

单宁的提取量随提取温度的升高不断增大(图1d)，说明在一定范围内增加提取温度有利于酚类物质的溶出，但温度过高，单宁易发生氧化反应，造成单宁化学结构的变化。故提取温度选择为70 ℃。

2.1.5 料液比的影响

随着料液比的增加，单宁提取量先呈上升趋势，在1∶20时达到最高，此时提取量为7.336 5 mg/g，最后随料液比增大呈下降趋势(图1e)。可能是因为在料液比为1∶20时，单宁在溶剂中的溶解已基本达到饱和，而在对提取液进行减压蒸发浓缩时，提取液始终保持微沸状态，会促使氧化反应发生，且所用溶剂越多，在浓缩过程中消耗的时间也越长，加大了浓缩时的能耗，故料液比选取1∶20较为适宜。

图1 单因素试验结果Fig.1 The results of single test

2.1.6 提取次数的影响

第1次所提单宁的量占总量的90.89%，第2次提取的量占总量的5.62%，2次所提单宁之和占总量的96.51%，后两次的提取操作占总量的极少部分，考虑到时间和试剂成本，提取次数以2次为宜。

2.1.7 最佳提取工艺的确定

在单因素试验的基础上，正交试验设计方案、试验结果及极差分析见表2。由表2中的极差分析可以看出，各因素对提取效果的影响顺序为提取温度(C)>料液比(D)>提取时间(B)>乙醇体积分数(A)，单宁提取的最佳组合是乙醇体积分数70%，提取时间120 min，提取温度70 ℃，料液比 1∶18(g∶mL)。在此条件下进行验证试验，提取量为8.248 4 mg/g，与正交试验中单宁提取量相差0.1%，说明该种提取方法精密度良好。

表2 单宁提取的正交试验结果Table 2 The design scheme,results and range analysis of orthogonal test

2.2 单宁的分布规律

以儿茶素质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制儿茶素标准曲线，回归方程y=1.107 7x-0.000 9，决定系数R2=0.999 9，标准品浓度与吸光度呈良好线性关系。所得分布规律结果如图2。

图2 西加云杉木材单宁分布情况Fig.2 Distribution of tannin in the wood of Picea sitchensis

2.2.1 径向分布规律

西加云杉木材内单宁含量在径向上的分布情况如下：1)内部心材(编号1～3)单宁含量范围在5.020～5.910 mg/g，平均为5.440 mg/g，由髓心至树皮方向略微呈上升趋势；2)近心边材转换区的心材部分含量最高，为10.015 mg/g，最多可达10.970 mg/g；3)心边材转换区部位单宁含量范围在5.940～6.440 mg/g，平均为6.363 mg/g，介于心材和边材之间；4)靠近心边材转换区的边材部分含量最低，为4.821 mg/g；近树皮边材仅次于近心边材转换区的心材部分，单宁含量在6.997 mg/g左右，最高可达7.440 mg/g。自髓心至树皮方向，单宁含量呈现先增后减再增的分布规律，心材含量(6.590 mg/g)总体高于边材(5.910 mg/g),在靠近转换区的心材部位单宁含量达到最高，在靠近转换区的边材单宁含量最低。在树木生长过程中，薄壁细胞死亡变为心材的同时分泌单宁等多酚类物质，水分输导系统阻塞，心材细胞内分泌物不断沉积，从而形成越来越多的内含物[15]。内部心材部分单宁含量由髓心至树皮方向呈逐渐上升趋势，是由于靠近髓心部位的木材形成时间早，单宁较易在氧气和酶等催化条件下分解，因此随着时间的延长，单宁也逐渐减少。近树皮边材单宁含量较高，可能是由于树皮部分单宁含量较高，木材养分横向输导过程中，部分物质通过射线细胞由树皮向内渗透造成的。

2.2.2 纵向分布规律

西加云杉木材单宁含量分布在纵向上呈下部各部位单宁含量略高于上部各对应部位含量的规律，相差0.19～0.71 mg/g，但无显著差异。不同树木的单宁含量在纵向上呈现出不同的规律。Caron等[16]在研究英国北部西加云杉丙酮抽提物的分布规律时，在纵向上并未发现显著差异；范国荣等[17]研究发现随着树高的增加，陈山红心杉的抽提物含量均呈现下降趋势。目前木材内酚类物质的株内纵向变异规律的尚无定论，除树高外，树龄也有一定影响，且抽提物的成因比较复杂，有的是树木正常生理活动和新陈代谢的产物，有的是受到外界条件的刺激引起的应激物，存在一定的不确定性。

2.3 单宁组分分析

2.3.1 单宁类型的确定

通过西加云杉木材内植物单宁的定性鉴定，单宁分子中的邻苯三酚基与铁盐反应呈蓝色，而水解单宁和缩合单宁中都可能含有邻苯三酚基，故判定西加云杉木材内含有单宁；在溴水反应中，缩合单宁的A环6位及8位为亲核性位置，容易与缺电子试剂发生取代反应生成6,8,2-三取代产物，产生橙黄色沉淀；缩合类单宁和水解类单宁与醋酸铅反应均能生成沉淀，但缩合类单宁可在稀醋酸中溶解，溶液无沉淀生成，说明不含水解单宁；缩合单宁A苯环化学活性较高，其上的间苯二酚或间苯三酚可与香草醛发生酚醛缩合反应，溶液由无色变为粉红色，证明其含缩合单宁。综上所述，西加云杉木材中单宁类型为缩合单宁。

2.3.2 组分分析结果

对试验方法进行精密度和回收率测试，相对标准偏差(RSD)均在5%以内，表明该试验方法具有良好的精密度和回收率。标准物质和待测样品所得色谱图如图3。采用外标法，以峰面积为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，得到 5 种原花青素成分的回归方程和相关系数，在0.1～1.0 mg/mL范围内均具有良好的线性关系。将测试所得峰面积值代入回归方程计算，所得各成分含量见表3。

图3 各标准物质色谱图Fig.3 Standard sample chromatogram

表3 5种原花青素含量检测结果Table 3 The test results of five procyanidins in samples

通过对西加云杉木材中的5种原花青素成分进行组分分析，确定了一种简单、快速准确测定西加云杉提取物中5种原花青素的高效液相色谱方法。西加云杉木材内5种原花青素成分含量存在明显差异，其中儿茶素含量最高，占5种原花青素总量的83.21%，原花青素B2次之，表儿茶素含量较低，没食子酸和表儿茶素没食子酸酯几乎没有。儿茶素为西加云杉木材植物单宁中的主要成分，约占总单宁含量的59.68%，原青花素B2次之，占比为10.25%。儿茶素类化合物具有2-苯基苯并二氢吡喃结构，属于黄烷醇类化合物，进一步佐证西加云杉中单宁类型为缩合单宁。儿茶素中含有酚羟基，遇金属离子如铁离子会发生螯合反应，生成不溶于水的蓝黑色螯合物鞣酸铁，可寻找与铁离子结合能力更强的试剂作为除色剂，将铁离子从鞣酸铁中置换出来，从而达到消除西加云杉木材铁变色的目的。