新型动物疫苗佐剂的研究进展

刘元杰，张 媛，王秀丽，张一帜，李 建，李俊平

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

目前我国动物疫苗佐剂仍然以铝盐佐剂为主，除此之外，也有油乳和蜂胶等佐剂疫苗批准生产并投入使用。佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，可辅助特异性抗原进入机体内，增强机体对目的抗原的免疫应答。一般认为，佐剂对疫苗作用的促进主要体现在两个方面：一是增加疫苗的稳定性，从而延长疫苗作用时间；二是激活机体免疫系统，增加疫苗作用强度。

目前针对新型疫苗佐剂的研究很多，主要有铝盐佐剂、油乳佐剂、天然佐剂、脂质体佐剂、纳米粒子佐剂、细胞因子佐剂等，部分新型佐剂已经普遍应用，还有部分正在研究和不断完善中。

1 铝盐佐剂

铝盐佐剂早在1926年就已经被批准使用，在此后也一直被广泛应用，直到现在仍然是动物疫苗中最主要的佐剂。铝盐佐剂可以诱导体液免疫反应，而且不会导致严重的副反应，具有较好的安全性[1]。铝盐佐剂价格低廉、工艺成熟，但也存在一定的缺点，如注射部位的红肿、过敏反应，不能诱导细胞免疫应答等。近年来，分子生物学和基因工程学发展迅猛，多种DNA疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗相继上市，传统铝盐佐剂分子质量小、免疫原性差等问题开始突显，已不能满足新型疫苗的更高要求。

2 油乳佐剂

油乳佐剂按油料区别可分为矿物油佐剂和非矿物油佐剂，按分散状态不同分为水包油、油包水和双相型乳液三种形式。目前应用和研究较多的油乳佐剂有白油佐剂、MF59、AS03等。

2.1 白油佐剂 目前市场上的动物油佐剂疫苗大多为白油佐剂。白油佐剂为矿物油佐剂，可以使抗原免疫时间延长，减少免疫次数。但其存在因黏度大导致的注射困难和注射部位炎症反应的问题。研究表明，影响白油佐剂免疫效果的主要因素为芳烃、重金属含量和白油运动的黏度两方面[2]。白油粒子的均一性对疫苗免疫效果影响不大，但是均一性更高的白油佐剂引起的炎症反应更轻[3]。

2.2 MF59 MF59是最具代表性的水包油佐剂，主要成分是角鲨烯，在肝脏中自然合成，易于降解。MF59中两种非离子表面活性剂吐温80和span85(山梨酸酐三油酸酯)可以起到稳定油滴的作用，从而增加疫苗作用时间。MF59诱导机体产生的体液免疫效果明显高于铝盐佐剂，同时诱导产生一定的细胞免疫反应。有研究显示MF59可以产生Th1型和Th2型细胞免疫反应，但是未发现CD8+毒性T细胞免疫反应的报道[4]。MF59已经应用于部分亚单位疫苗中，其安全性高，扩散快，而且不形成抗原储库[5]，但需要抗原与佐剂免疫相同位置才能增强免疫反应。有学者将自主构建的H7N9禽流感病毒疫苗加MF59制备成品疫苗，验证了以MF59为佐剂的禽流感疫苗不仅具备长期免疫原性[6]，而且有良好的稳定性，在2～8 ℃至少可保存30个月[7]。

2.3 AS03 AS03是葛兰素史克公司在2009年研发的一种佐剂系统，与MF59相比，增加了一种主要成分α-生育酚。该物质可以增加诱导产生的细胞因子水平，促进单核细胞的抗原摄取水平，进一步提高诱导产生的抗体水平[8]。目前AS03已经被用于H5N1流感病毒疫苗[9]和 H7N9 流感病毒疫苗[10]临床试验阶段的研究。

新型油乳佐剂的研究还有很多，如同样由葛兰素史克公司研发的AS02已经被应用于结核病的临床试验阶段[11]。姜佳琪等[12]对SP01佐剂进行了安全性评价，验证了其无毒，且对实验动物无过敏性反应。

油乳佐剂通过油乳本身对抗原的包裹使抗原可以在机体内持续存在，从而使抗原刺激的时间延长，免疫效果大幅提高[13]。但也正是因为油乳佐剂这个特点，在持续的刺激下，机体中容易出现组织损伤、应激反应、矿物油的残留等，存在一定的安全隐患。未来针对油乳佐剂的研究方向在于如何在保证其长效抗原刺激的同时进一步提高其安全性，避免因长期存在于体内造成各种不良反应。

3 天然佐剂

天然佐剂主要来源于天然植物中提取的某些具有免疫活性的成份，这些成分具有毒性低、易于代谢的特点，主要包括蜂胶佐剂和壳聚糖佐剂等。

3.1 蜂胶佐剂 蜂胶是由从植物中提取的树脂和蜜蜂分泌物经特定工序加工而成的胶状物质，可以增强机体的体液免疫反应，增强巨噬细胞的吞噬能力，增加白细胞数量，刺激细胞因子产生，从而使免疫效果得到显著提高。因其为天然物质，与其他类型佐剂相比安全性较高。翟晓虎等[14]在猪细小病毒疫苗的研制过程中比较了油佐剂与蜂胶佐剂，发现蜂胶佐剂可以提高豚鼠细胞免疫和早期体液免疫。赵晶[15]比较了不同类型的蜂胶佐剂和其他佐剂猪圆环病毒疫苗活性的促进作用，结果显示蜂胶佐剂猪圆环病毒疫苗能显著增强猪群的特异性免疫和非特异性免疫，且具有良好的安全性，为蜂胶佐剂疫苗临床推广应用提供了数据支撑。

近年来蜂胶佐剂的应用已经十分广泛，在特定种类疫苗中，蜂胶佐剂疫苗的生产数量已经远远超过传统疫苗，有逐渐取代传统疫苗的趋势。统计2017-2019年部分细菌灭活疫苗批签发数据，其中禽大肠杆菌类灭活苗、禽多杀性巴氏杆菌类灭活苗、猪链球菌类灭活苗三种主要细菌相关产品中蜂胶佐剂疫苗生产量占比分别为51.8%、30.4%、30.9%，从数量上看蜂胶苗在灭活苗中已经占据了相当大的比例。

3.2 壳聚糖佐剂 壳聚糖是天然中存在的碱性多糖，化学性质稳定，可溶于部分无机酸中，但不溶于水。壳聚糖中游离的氨基和羟基可通过氢键和静电吸引作用吸附于机体粘膜上[16]。通过作用于Toll样受体4诱导巨噬细胞和树突细胞的活化[17]，提高共刺激膜蛋白CD80和CD86的表达，从而激活免疫系统。壳聚糖能在较温和条件下进行一系列化学修饰，形成具有不同生物特性的衍生物[18]。壳聚糖-三磷酸盐是近年来研发出的多聚糖衍生物，克服了壳聚糖在生理pH下溶解度低的缺点，延长抗原释放时间并降低降解率，从而提高疫苗的有效性[19]。壳聚糖是存在于昆虫甲壳中的天然物质，在生产过程中成本相对较低，而且具有良好的生物相容性，安全性较高[20]。在壳聚糖类佐剂应用的过程中，使用黏膜免疫的方法更有利于发挥其本身黏膜吸附性的优势。通过黏膜免疫的方法，在黏膜中可以产生分泌型IgA抗体，这说明壳聚糖可以促进机体的黏膜免疫[21]。

尽管壳聚糖有着安全性和黏膜吸附性的优势，但在实际应用的过程中还存在两个主要问题。其一是溶解性低。壳聚糖本身不易溶于水，不利于在机体中发挥作用。一般可以通过化学修饰来提高其溶解性，但是在化学修饰过程中很难避免出现因重金属残留而导致的毒性增加。未来壳聚糖改造工艺仍然有待进一步研究。其二是黏膜免疫在机体中存在的各种阻碍，如口服易在胃中被消化，滴鼻在鼻腔内作用时间短等问题。可以通过将壳聚糖转化为纳米粒的形式来保证疫苗在体内的持续性。有学者将新城疫病毒F基因 DNA 疫苗封装到壳聚糖纳米粒中，促进了黏膜免疫传递系统的持续释放，提高了免疫效率[22]。

4 脂质体佐剂

4.1 类病毒颗粒 类病毒颗粒是模拟病毒表面蛋白结构的非感染性空衣壳，可以诱导体液免疫反应和CTL等细胞免疫反应，还可以传递多肽、蛋白质等大分子物质[23]。不同于其他病毒样颗粒，类病毒颗粒不是在宿主内合成，而是在体外装配形成，所以不具有感染性。与铝盐佐剂相比，类病毒颗粒具有更高的安全性，因其本身为膜蛋白，更容易降解。目前类病毒颗粒已经被广泛应用于亚单位疫苗的载体和佐剂，如以此为基础的流感疫苗和乙肝疫苗已经上市[24]。

4.2 AS01 AS01是由单磷酸脂质体(MPL)和皂素QS-21作为免疫激活剂辅以脂质体组成。与一般油乳佐剂不同，QS-21的作用机制并非延长抗原在机体内的存在时间，因为QS-21和抗原注射机体后24 h就不能检测出QS-21的存在[25]。AS01的作用机制在于MPL和QS-21联合作用于抗原，将特异性免疫反应的效力达到最大，刺激细胞毒性CD8+T细胞的产生[26]。2015年，应用AS01佐剂技术研发的疟疾疫苗已经被欧洲药监局批准使用。在结核病的临床试验中，AS01 佐剂也作为重要的技术手段被加以应用[27]。

4.3 AS04 AS04是由铝盐佐剂添加MPL制备而成，相比铝盐佐剂可以更高水平地诱导体液免疫反应和Th1型细胞反应。AS04已经被批准应用于人宫颈癌的预防[28]和乙型肝炎疫苗[29]。

脂质体佐剂在安全性和免疫原性上具有显著优点，但是制作工艺复杂，成本较高。目前脂质体佐剂主要应用于人用疫苗，未来在大量生产中还有很大的技术难题需要攻破。不过其作为一种高效、安全的新型佐剂，未来在动物疫苗领域也有很大的应用前景。

5 纳米佐剂

纳米佐剂是指用聚合物类等纳米粒子材料制成的佐剂，具有独特物理性质，既可避免渗入血管，又可限制纳米粒子在淋巴管中的传输速度。纳米粒子佐剂的优势在于可通过多种途径与免疫系统的细胞相互作用，促进APCs的交叉递呈，提高抗原对异型病毒的交叉保护力。而且其化学性质稳定，可以在不改变药物作用机理的条件下发挥作用。生物相容性材料的应用促进了其在生物体内的吸收和降解，使纳米粒子佐剂有着高于传统佐剂的安全性。

PLGA(poly lactic-co-glycolic acid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)是一种聚合物类纳米粒，在机体中可自行降解。在美国，PLGA通过食品和药品管理局(FAD)认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。用 PLGA 包被的禽流感病毒经多种途径免疫都明显增强了抗体介导的免疫反应[30]。简敏捷[31]以聚乙二醇-400(PEG-400)作为材料包裹产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)蛋白，开辟了治疗ETEC的新方法。α-甘露聚糖肽是一种聚糖类有机纳米物质，作为佐剂能够在转基因小鼠模型上提高E75乳腺癌疫苗的免疫效应,具有增强基于细胞免疫的多肽类肿瘤疫苗免疫原性的能力[32]。

目前针对于纳米粒子佐剂的研究以人类肿瘤病为主。在技术上，因人与动物本身免疫系统的差异导致在选取纳米材料上存在一定的技术难题，因为不同纳米材料理化性质差异较大，由此免疫策略也不相同。

6 细胞因子佐剂

细胞因子是机体产生的具有广泛生物调节性质的调节因子，具有免疫佐剂效应的细胞因子有干扰素和白细胞介素等。例如IL-2、IL-12和IFN-γ可促进Th1细胞的刺激，从而产生对细胞内病原体细胞介导的免疫应答，IL-4、IL-5和IL-10可促进Th2 细胞的发育和抗体产生，在宿主抵御细胞外病原体中发挥着重要作用。柏玲等[33]在研制水貂阿留申病毒(ADV)VP2核酸疫苗时，构建了IL-12、IFN-γ细胞因子真核表达质粒，并且在体外细胞水平鉴定了上述目的基因的成功表达。匡露寒等[34]在禽腺病毒亚单位疫苗的研发过程中添加鸡源白细胞介素和γ-干扰素作为免疫佐剂，增强了疫苗的免疫保护效果。

细胞因子佐剂在使用的过程中不仅可以促进特异性免疫反应，也可以最大激发非特异性免疫，应用前景十分广泛。但是就临床应用而言，目前细胞因子佐剂还存在半衰期短、价格昂贵的问题[35]。除此之外，对剂量的把握也是细胞因子佐剂在应用过程中亟待解决的难题，因为剂量使用不当可能会导致潜在的自身免疫安全隐患。

7 Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)

TLRs是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR作为非催化性跨膜蛋白，可以识别微生物中具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫应答。

目前已经鉴定的TLRs共有15种，不同动物所含TLRs种类略有不同，如在哺乳动物中有13种[36]，而禽类中有10种。不同种类的TLRs功能不同，如TLR1-6和TLR10等主要在细胞表面表达，可以识别脂蛋白、肽聚糖、鞭毛等病原体细胞膜成分；TLR3、TLR7-9等又被称为抗病毒 TLRs，可以作为胞内受体识别细胞内外源双链RNA[37]；TLR4和TLR5可以识别细菌脂多糖和鞭毛蛋白[38]。Bashir K等[39]在IBDV疫苗中使用了TLR2 配体和TLR3 配体为佐剂，促进了T细胞和巨噬细胞的功能，维持疫苗的免疫活性，减少了IBDV疫苗的副作用。Bhardwaj R等[40]使用TLR4 配体 LPS作为鸡新城疫疫苗佐剂，血液和组织样品中IL-12、IFN-γ、IL-4和TLR4的含量和血清效价均得到一定程度的上调，验证了LPS引发的抗原特异性体液和细胞免疫应答的结论。

8 结 语

目前市场中兽用疫苗绝大多数仍然为铝盐佐剂疫苗，油乳佐剂疫苗和蜂胶苗也在市场中占重要地位。一些新型佐剂的研发是在已经成熟应用佐剂的基础上添加新成分，如AS04在铝盐基础上添加了MPL，邹勇娟等[41]将白油佐剂与壳聚糖微球混合作为禽流感疫苗佐剂。未来佐剂的研发方向倾向于多种佐剂组合使用，充分发挥每种佐剂的优势。蜂胶佐剂在灭活疫苗中占有一定的比重，但仍然有进一步发展的空间。以猪链球菌类灭活疫苗产品为例，虽然从数量上来看，蜂胶苗在灭活苗中占比达到30.9%，但蜂胶苗种类在灭活苗种类中占比只有16.7%。蜂胶苗产量大，但种类并不多，这也恰恰说明了已有蜂胶苗已经被市场所认可。不过，蜂胶佐剂虽然在部分特定种类疫苗中市场数据可观，但其免疫效果仍需要进一步跟踪观察，针对蜂胶佐剂的作用机理也需要进一步研究。未来可以应用蜂胶佐剂技术对已有传统疫苗进行升级改造，扩大蜂胶佐剂的应用范围。纳米佐剂、脂质体佐剂、细胞因子佐剂等技术手段相对复杂，还有很大的技术难题需要攻破，如纳米佐剂的材料选取难题和细胞因子佐剂的剂量控制难题。除此之外，成本问题也是疫苗在临床应用过程中必须面对的问题。当前已经被批准使用的如MF59、AS系列佐剂和重构流感病毒颗粒等主要应用于人用疫苗，这些技术在未来动物疫苗领域的应用具有很大空间，随着技术的不断完善，相信会有越来越多的新型动物疫苗出现。