双葛止泻口服液微生物限度检查方法学验证

桑卡娜，李焕娟，杨绒娟，周德刚

(洛阳惠中兽药有限公司，国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471003)

双葛止泻口服液是由洛阳惠中兽药有限公司、普莱柯生物工程股份有限公司和河南新正好生物工程有限公司联合研制的三类新兽药。双葛止泻口服液由金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍和炙甘草组成，来源于《伤寒论》中的“葛根芩连汤”。方中金银花具有解热、抗炎、抗病毒等药理作用[1-2]，葛根芩连汤对感染性腹泻具有一定的治疗作用[3-4]。由于中药复方成分复杂，中药制剂中的不同成分对微生物有一定的抑制和杀灭作用，常规法进行微生物限度检测，不能真实反应样品中的微生物情况，需采用适当的方法，例如薄膜过滤法、中和剂、培养基稀释法等，去除其抑菌作用，并对方法进行验证来确定所采用的微生物限度检查方法的可行性和有效性[5-7]。依据2015年版 《中华人民共和国兽药典(二部)》通则1102非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，以及通则1103非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法和通则1104非无菌兽药微生物限度标准进行方法适用性试验，建立适合双葛止泻口服液的微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器 集菌仪，型号HTY-602，浙江泰林生物技术股份有限公司；电子天平，型号JA2003，上海上平仪器有限公司；电热恒温培养箱，型号DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司；生化培养箱，型号SPX-150BSH-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司；生物安全柜，型号Nu-425-400S，美国Nuaire公司；全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅，型号YXQ-LS-100A，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；微量移液器，规格100 μL、1000 μL、5 mL，德国Eppendorf公司；电动移液枪，型号E4XLS，规格20～200 μL，美国Rainin公司。

1.1.2 供试品 双葛止泻口服液；批号：20170201；规格：每1 mL相当于原生药0.45 g；包装：口服液体药用聚丙烯瓶；生产厂家：洛阳惠中兽药有限公司。

1.1.3 菌株、试剂及材料 金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC(B)10104〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕，购自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心。

胰酪大豆蛋白胨液体培养基，批号20170116；胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基，批号20161018；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号20160924；沙氏葡萄糖液体培养基，批号20160224；麦康凯琼脂培养基，批号20170113；麦康凯液体培养基，批号20161222；麦康凯琼脂培养基，批号20161021；pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号20160321；Kovacs氏靛基质，批号20161117；甲基红试剂盒，批号20161208；V-P试剂盒批号，20170214，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。量筒、EP管、一次性无菌平皿、涂布棒、试管架、酒精灯、镊子。无菌薄膜过滤器，型号FC752，浙江泰林生物技术股份有限公司。

1.2 试验方法 依照2015版《中华人民共和国兽药典(二部)》通则1102、1103、1104[8]有关非无菌产品微生物限度检查方法进行验证。

1.2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌第二代甘油保存物100 μL加到10 mL胰酪大豆蛋白液体培养基中，置35 ℃培养24 h。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌培养物1 mL加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5、10-6、10-7，取稀释液各0.1 mL加入制备好的胰酪大豆蛋白胨琼脂平皿，涂布棒涂匀后置35 ℃培养24 h，每个稀释度3个重复，计菌落数。

取白色念珠菌的第二代甘油保存物100 μL加到10 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，置25 ℃培养48 h。取培养物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4、10-5、10-6，取稀释液各0.1 mL加入制备好的沙氏葡萄糖琼脂平皿，涂布棒涂匀后置25 ℃培养2 d，每个稀释度3个重复，计菌落数。

取黑曲霉冻干粉，溶于0.9%氯化钠溶液中，混匀，用接种环蘸取，划线接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，置25 ℃培养5 d。取沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液5 mL，洗下孢子，转移至另一空管，取1 mL加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4、10-5、10-6，取稀释液各0.1 mL加入制备好的沙氏葡萄糖琼脂平皿，涂布棒涂匀后置25 ℃培养5 d，每个稀释度3个重复，计菌落数。

在大兴安岭，最早的春色出现在向阳坡。嫩绿的草芽像绣花针一样顶破丰厚的腐殖土，要以它的妙手，给大地绣出生机时，背阴山坡往往还有残雪呢。这样的残雪，还妄想着做冬的巢穴。然而随着冰河乍裂，达子香花开了，是透着清香的树、烂漫的山花和飞起飞落的鸟儿。那蜿蜒在林间的一道道春水，被暖风吹拂得起了鱼苗似的波痕。投在水面的阳光，便也跟着起了波痕，好像阳光在水面打起蝴蝶结了。

1.2.2 计数方法适用性试验

为了评价实验结果的精度,计算了重复性实验的相对标准偏差和平均相对误差。在全量程范围内和同一工作条件下,传感器系统的重复性误差指标以相对标准偏差RSD表示,其计算公式如下[19]:

判定依据：试验组检出大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长，则试验成立。反之，则判断试验无效。试验组若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。

试验成立时，供试品组麦康凯琼脂培养基平板上无菌生长，或者虽有菌生长但鉴定结果为阴性，判定未检出大肠埃希菌。

供试品对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，取供试液10 mL加入100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，加入薄膜过滤器的滤筒中过滤，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL。

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菌液对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，用100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液过滤，再用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓缓冲液冲洗3次，每次100 mL，最后一次冲洗时，冲洗液中加入不大于100 CFU/mL的试验菌1 mL，摇匀后，滤过滤膜。

课堂是语文教学的主阵地，与我们朝夕相处的课本，它是一座富矿，是一口深井，是提高学生语文素养的力量源泉。用足语文课本，开动脑筋，灵活处理好中华优秀传统文化的传承，有利于学生的健康发展，全面发展。

阴性对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL。

结果分析：选用计数方法适用性试验中较常见的金黄色葡萄球菌作为添加菌株，由计数方法适用性试验结果可知，菌液回收比值为0.421，未在药典规定的0.5～2之间，菌液回收率较低，表明本试验供试品双葛止泻口服液具有一定的抑菌作用，需要采用一定的方法消除其抑菌作用，保证菌液回收率在0.5～2范围内再进行微生物计数检测。

1.2.2.1 常规法(培养基平皿倾注) 试验组：无菌取供试液1 mL和稀释至不大于100 CFU/mL的金黄色葡萄球菌1 mL注入无菌培养皿后，倾注20 mL 胰酪大豆胨琼脂培养基于平皿中，混匀，制备2份平行样本的平皿放入培养箱中，35 ℃培养48 h，计数后取平均值。供试品对照组：参照试验组的方法，不加菌液，测供试品的菌数。菌液对照组：参照试验组的方法，不加供试品，测供菌液的菌数。结果判定：菌液回收比值=(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液对照组菌数。

1.2.3 控制菌检查(常规法) 无菌操作取2瓶双葛止泻口服液混合均匀后，取出10 mL至无菌玻璃瓶中，加入pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10的供试液。

取100 mL胰酪大豆胨液体培养基3瓶，试验组加入10 mL供试液及不大于100 CFU/mL的大肠埃希菌1 mL；菌液对照组加入10 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液及不大于100 CFU/mL的大肠埃希菌1 mL；供试品对照组加入10 mL供试液。同时设阴性对照组。混匀后置于35 ℃培养24 h。

结果分析：由常规法可知，双葛止泻口服液具有一定的抑菌作用，需要采用一定的方法消除供试品的抑菌活性。由于本产品为中药口服溶液，水溶性好，可顺利通过滤膜，故采用较常用且去除抑菌作用效果好的薄膜过滤法进行方法验证。

表1 大肠埃希菌与非大肠埃希菌的生化鉴别

1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。2：IMViC 生化试验为“++--”或“-+--”判定为大肠埃希菌。

1.2.2.2 薄膜过滤法 制备供试液：无菌操作取2瓶双葛止泻口服液混合均匀后，取出10 mL至无菌玻璃瓶中，加入pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10的供试液。分别按以下方法对5种试验菌株进行计数方法适用性试验。试验组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，取供试液10 mL加入100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，加入薄膜过滤器的滤筒中过滤，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL，最后一次冲洗时，冲洗液中加入不大于100 CFU/mL的试验菌1 mL，摇匀后，滤过滤膜。

5) 换向。当车钟手柄从非海上全速正车位置直接扳到倒车任意位置时，主机转速下降到制动转速，输出停车指令控制主机停机，待主机停机之后反向启动主机。

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2 结果与分析

2.1 菌液计数 各菌株菌落计数结果如表2所示，根据计数结果用0.9%氯化钠溶液将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌10倍稀释至10-7，白色念珠菌10倍稀释至10-6，黑曲霉菌10倍稀释至10-5，约为不大于100 CFU/mL的菌悬液备用。

表2 细菌计数结果(CFU/mL)

2.2 计数方法适用性试验结果

2.2.1 常规法(培养基平皿倾注) 采用常规平皿法培养基倾注进行样品中需氧菌总数的方法验证，具体结果见表3所示。

表3 常规法进行方法适用性检查

过滤完成后将滤膜取出，将滤膜的菌面朝上贴于琼脂平板上。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌制备的滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，35 ℃培养3 d，计数。白色念珠菌和黑曲霉平行制备2份滤膜，一份贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，35 ℃培养5 d，计数；另一份贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，25 ℃培养5 d，计数。

2.2.2 薄膜过滤法 采用薄膜过滤法，每个样品冲洗3次，100 mL/次，并重复进行3次独立平行薄膜过滤法试验验证，计数验证结果见表4和表5。

从我国刑法的发展过程来看，自从新中国第一部刑法典诞生以来，我国刑事立法在总体上就呈现出扩张刑法惩罚范围的态势，并且，在很长的一段历史时期内，可以预见，我国刑法的发展方向依然是犯罪化。近年来刑法修正案对金融犯罪、有组织犯罪、环境犯罪、食品安全犯罪、贪污贿赂犯罪以及侵犯公民人身和财产权利的诸多罪名的入罪标准和构成形态的修改足以说明，我国刑事立法呈现出大规模的犯罪化的趋势，以积极而充分发挥刑罚对社会基本安全和秩序的塑造和保护作用。

表4 需氧菌总数计数方法验证结果(CFU/皿)

表5 霉菌和酵母菌总数计数方法验证结果(CFU/皿)

取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，35 ℃培养24 h。麦康凯琼脂培养基上若有菌落生长，挑取符合大肠埃希菌菌落特征(鲜桃红色，圆形，边缘整齐、表面光滑)的菌落在麦康凯琼脂培养基上划线培养，挑取符合大肠埃希菌菌落特征的菌落进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用实验。大肠埃希菌与非大肠埃希菌的生化鉴别见表1(GB 4789.38-2012)。

结果可知，各试验菌试验组菌落数减去供试液对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内，符合《中华人民共和国兽药典》 适用性试验要求规定。且阴性对照均无菌生长，本方法可用于双葛止泻口服液需氧菌和霉菌及酵母菌的总数测定。

2.3 控制菌检查结果 依据《中华人民共和国兽药典》2015版二部1103非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法和1104非无菌产品微生物限度标准，本产品双葛止泻口服液，应检测的控制菌为大肠埃希菌。采用常规法进行控制菌方法验证，结果如表6所示。

表6 控制菌方法验证结果

结果分析：试验组与菌液对照组麦康凯平板上有菌落生长，IMViC生化试验鉴定结果均为“++--”，供试品对照组和阴性对照组无菌生长。证实了常规法可用于双葛止泻口服液大肠埃希菌控制菌检查，此方法成立。

3 讨论与结论

3.1 方法验证的必要性 中药制剂成分复杂，其中任何成分具有抑菌性均可影响微生物限度检查的准确性。2015版《中华人民共和国兽药典》规定，中药制剂进行微生物限度检查时，对可能具有抑菌作用的产品，必须首先采用合适的方法消除其抑菌作用，再进行对应供试品的检查。因此，微生物检测方法必须经过方法的适用性试验验证[9-10]，才可确保微生物检查方法的可靠性和检查结果的准确性。

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3.2 微生物计数法 双葛止泻口服液由金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍和炙甘草组成，其组分中金银花、黄芩对金黄色葡萄球菌等菌株均有一定的抑制作用[11]，由本试验结果可知，常规法进行需氧菌总数的测定时，菌液回收比值较低(0.421)，未能达到试验要求(菌液回收比值0.5～2)。故采取薄膜过滤法消除其抑菌作用后，再次进行微生物计数方法学考察，薄膜过滤法采用一次性无菌过滤器，将外界影响和操作者的主观因素减少到最低，是检验各种成分剂型的首选方法[12]。双葛止泻口服液采用薄膜过滤法可消除其抑菌作用，各菌回收率均在规定范围内。

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3.3 控制菌检查法 依照《中华人民共和国兽药典》2015版规定[8]，双葛止泻口服液应对大肠埃希菌进行控制菌检查，本研究采用常规法进行控制菌检查，方法成立。供试品双葛止泻口服液在微生物计数法验证时，常规法菌落回收比值(0.4)，低于0.5，表明本产品具有一定的抑菌作用，但抑菌作用较轻微。在进行控制菌检查时，常规法方法验证合格。分析原因为控制菌检查时所用培养基体积较多，有培养基稀释去除抑菌作用的原因。故本供试品检查时，微生物计数法需采用薄膜过滤法，控制菌检查法可采用常规法。

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供试品双葛止泻口服液的细菌、霉菌和酵母菌计数方法采用薄膜过滤法，控制菌检查方法可采用常规方法进行。