土壤中头孢噻呋的高效液相色谱检测方法的建立

安博宇，徐向月，霍美霞，马文瑾，王涵宇，刘振利，程古月,*，黄玲利,*

(1.华中农业大学农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室，武汉 430070；2.华中农业大学国家兽药残留基准实验室(HZAU)，农业部食品兽药残留检测重点实验室，华中农业大学动物医学院，武汉430070)

当今抗生素尤其是兽用抗生素对环境的污染受到了世界各国的广泛关注，其存在于环境中不仅会对动植物和微生物造成毒性，也会诱导环境微生物产生耐药性并传播。我国作为抗生素的使用大国，仅在2018年我国兽用抗生素使用的总量就高达29774.09吨[1]。如此大量的兽用抗生素经过动物体排入环境后，势必会对土壤或水体环境造成严重的污染[2]。头孢噻呋(Ceftiofur)又名赛德福，是20世纪80年代由美国普强公司开发并被批准应用于治疗动物细菌性疾病的第三代头孢菌素类药物[3-4]。由于其抗菌活性强，毒性较低，副作用较小，因此，成为市场上应用最为广泛的兽用头孢菌素类药物。由于我国不合理用药的现象比较常见，临床上的病原对其耐药性现象十分严重。因此，人们不仅要关注临床用药的合理规范，也要注意抗生素对环境的污染以及对环境微生物耐药基因的诱导作用[5-7]。根据之前的研究，头孢噻呋在动物用药后，约20%～30%的活性物质会随粪便和尿液排入环境[4]，这些化合物以原型药物为主，其进入环境后不仅会影响微生物群落结构，也会诱导耐药基因的产生，因此，对其环境污染的研究是非常有必要的[8]。对于头孢噻呋的检测方法，目前研究较多的是在组织和血浆中[9-12]，而在环境样品(粪便、堆肥、污水)中的检测研究较少[13-16]。目前环境样品中抗生素的检测最常见的是高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)。这两种方法中HPLC-MS/MS方法具有更好的灵敏度，相比于HPLC法其仪器价格昂贵，成本较高[17]。HPLC分析方法具有应用范围广，成本较低，更稳定等特点，被广泛应用于物质的定量分析。本研究选择砂土、壤土、砂壤土、黏土4种不同类型的土壤为研究对象，开发了土壤中头孢噻呋的定量检测方法，以期为头孢噻呋及其同类药物环境行为研究提供方法学参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、耗材与试剂 Waters 2998高效液相色谱仪(配备PDA检测器)；万分之一电子天平(SQP，购自北京赛多利科学仪器有限公司)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色谱柱；固相萃取装置；微型涡旋振荡器(WX-80A，购自上海沪西分析仪器厂有限公司)；超声波清洗机(KQ-3200，购自昆山市超声仪器有限公司)；Waters Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60 mg，Waters公司)；高速冷冻离心机(HITACHI CR21G，日立公司)；纯水仪(购自美国Milli-Q公司)；分析天平(型号AW120，购自日本SHIMADZU公司)。

头孢噻呋标准品(纯度≥89.5%)，购自湖北赛因斯实验设备有限公司，100 mg；硼酸钠；氯化钾；甲醇和乙腈均为HPLC级；三氟乙酸、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液及提取液的配置 准确称取头孢噻呋标准品11.2 mg，溶解在2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入超纯水定容至10 mL，配置成浓度为1000 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存备用。

硼酸缓冲液：称取3.7 g氯化钾和19 g四硼酸钠，用超纯水溶解并定容至1 L(pH为9)。

1.3 供试土壤样品的采集及理化性质 土壤采自华中农业大学水稻田边土壤，黏土采自华中农业大学水稻田池塘边土壤，砂壤土采自华中农业大学狮子山上，砂土采自武汉白沙洲大桥附近。以上土壤使用多点采样法从表层土壤顶部0～20 cm收集三个子样本混合在一起得到复合样本，自然风干。其中一部分过2 mm筛用于土壤实验，另一部分过1 mm筛用于测定土壤的基本理化形式。土壤颗粒组成用比重法测定，阳离子交换量(CEC)使用乙酸铵法测定，有机质含量(OC)使用重铬酸钾容量法测定，土壤pH使用电位法测定(水土比=5∶1)。上述土壤经检测不含目标抗生素。四种土壤的相应理化性质见表1。

表1 四种土壤的理化性质

1.4 样品提取与净化 称取土壤1 g和0.15 g Na2EDTA于10 mL离心管中，加入硼酸缓冲液4 mL，涡旋2 min混匀，超声10 min，10000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一只10 mL离心管中。再分别加相同量提取液重复提取一次。进行固相萃取，取固相萃取HLB柱(60 mg，3cc)依次用3 mL 甲醇、3 mL 超纯水活化。样品过柱，过完后用2 mL超纯水淋洗，真空条件下干燥5 min，再用3 mL甲醇洗脱两次，收集洗脱液，40 ℃水浴氮气吹干，用1 mL初始流动相[0.1%三氟乙酸：乙腈=4∶1(V∶V)]复溶，溶液过0.22 μm微孔滤膜，HPLC分析。

1.5 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱(4.6×250 mm)；流速1 mL/min；柱温25 ℃；波长295 nm；进样量20 μL；流动相：A相为0.1%三氟乙酸，B相为乙腈，梯度洗脱程序见表2。

表2 液相色谱梯度洗脱比例

1.6 方法性能考核

1.6.1 标准曲线的制备 根据头孢噻呋在环境中可能出现的浓度，将标准曲线的范围设置为0.05～10 μg/mL，取4 mL离心管数只配置成含有头孢噻呋浓度为0.05、0.2、1、5、10 μg/mL的药液1 mL，取20 μL进行HPLC检测，绘制加药浓度与峰面积的曲线图，考察方法的线性关系，并得出回归方程。

1.6.2 准确度和精密度 1 g空白土壤样品分别添加0.05、0.1、1 μg/g的头孢噻呋，作为低、中、高浓度，按照样品前处理的步骤处理后进行HPLC测定，每个浓度设置5个重复，通过单点校正法进行回收率的测定，作为准确度考核结果。这些样品每天重复走样三次，连续测定3 d，得出日内和日间变异系数作为该方法的精密度考核。

1.6.3 检测限和定量限 1 g空白土壤中加入一系列低浓度头孢噻呋标准品，其浓度分别为0.2、0.1、0.05、0.04、0.03 μg/g，每个浓度做5个平行样品，按照上述样品前处理步骤处理后进行检测，以S/N=3时的最低药物浓度作为该方法的检测限，以S/N=10时的最低药物浓度作为该方法的定量限。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围与检测限和定量限 目标物质在0.05～10 μg/mL范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=87.545x+4123.6，相关系数r2为0.9998。按照信噪比为3时的最低浓度作为检测限，信噪比为10时的最低浓度作为定量限，得到四种土壤的检测限为30 μg/kg，定量限为50 μg/kg(图1)。

图1 头孢噻呋标准曲线

2.2 方法的准确度和精密度 根据1.6.2项中的步骤得到回收率和日间变异系数作为方法的准确度和精密度，准确度范围是70.8%～85.6%，日内变异系数范围是3.8%～9.8%，日间变异系数范围是4.1%～10.6%，相应结果见表3。头孢噻呋在四种土壤的添加色谱图见图2。

表3 四种土壤中头孢噻呋的回收率、日内和日间变异系数

图2 壤土、黏土、砂壤土、砂土100 μg/L添加提取色谱图(A:壤土B:黏土C:沙壤土D:砂土)

2.3 提取pH的选择 本研究同时比较了不同pH缓冲液条件下的提取效果(磷酸盐缓冲液pH=3、4、5、6、7以及硼酸盐缓冲液pH=9、11)。根据结果pH=3、4、5、6、7时回收率最高只有60%左右,而pH=11时无法将头孢噻呋提取出来，当pH=9时提取效果最好,回收率可达70%以上(图3)。

图3 不同提取pH条件的回收率

2.4 提取试剂的选择 本研究除了硼酸缓冲液之外，还使用了pH为4的磷酸缓冲液乙腈不同比例混合提取液(V∶V=1∶1、1∶2、2∶1)、超纯水、乙腈水(V∶V=4∶1)，结果表明，硼酸缓冲液能够有效的将头孢噻呋从土壤中提取出来且回收率最高。最终选择pH=9的硼酸缓冲液作为提取试剂，各个提取试剂的回收率如图4所示。

图4 不同提取试剂的回收率

2.5 洗脱条件的选择 同时对比了甲醇、乙腈、乙酸乙酯三种常用的洗脱试剂，结果表明甲醇的洗脱效果最好，而乙腈和乙酸乙酯无法将头孢噻呋洗脱下来，检测不到色谱峰，最终选择甲醇作为最终的洗脱试剂。

3 讨论与结论

3.1 提取试剂的选择 对于土壤基质来说，主要干扰检测的因素为金属离子和土壤的吸附能力，通过加入EDTA来有效的降低金属离子对检测的干扰，碱性缓冲液能够更好的去除土壤对酸性药物的吸附作用[18,13]。目前国内外研究中，提取土壤中的兽用抗生素大多使用乙腈和缓冲液以一定比例混合作为提取试剂[19]，本实验中也尝试了此方法，但是提取的上清液均出现一定浑浊，并且回收率也比较低，原因可能是乙腈虽然具有较强的提取能力，但其会溶解土壤中的一些亲脂性物质，对分析造成干扰。在尝试了几种提取试剂后最终选取pH=9的硼酸缓冲液作为提取试剂。本文中黏土的回收率相较于其他三种土壤存在差异，黏土的有机质含量明显高于另外三种土壤，对于头孢噻呋来说，其在这种土壤中吸附量更大，分子之间的吸附相较于另外几种土壤不易破坏，因此，回收率会比另外三种土壤低一些，但也可以达到检测要求。

3.2 提取pH条件的选择 在不同提取pH条件下可以发现在pH=9使回收率达到70%以上，而pH在偏中性或者强碱性条件下回收率达不到要求，而强酸性条件下回收率可以达到60%以上但不如弱碱性环境回收率高，原因可能是酸性条件下无法破坏土壤和头孢噻呋之间的吸附作用，碱性过强时由于头孢噻呋本身pKa等于2.5～3.1，属于强酸性药物，在碱性较强(pH>11)的环境下相对不稳定[4]，其会在很快的时间(几小时)内达到降解半衰期[20-22]。

3.3 洗脱条件的选择 对于洗脱试剂来讲，由于本实验中使用的是HLB小柱，为亲脂亲水平衡柱，一般在洗脱时不需要调pH，三种洗脱试剂中甲醇的洗脱效果最好，可能是由于头孢噻呋的极性与甲醇的极性相似，而乙酸乙酯和乙腈的极性均低于甲醇，无法将药物完全洗脱下来，因此，最终选择甲醇作为洗脱试剂。

本研究建立了一种高效液相色谱法检测土壤中头孢噻呋的方法，采用pH=9的硼酸缓冲液提取，经HLB小柱净化后进行分析。该方法专属性较强、灵敏度高、重现性好、成本较低、回收率和精密度均可达到检测要求，可以用来检测四种土壤中的头孢噻呋含量，为今后头孢噻呋的环境行为研究提供了方法学借鉴。