血浆保存时间和制备方法对冷沉淀凝血因子质量的影响

单泓，李建斌，别立莉，刘敏，李晓晖，王姣杰

(河南省红十字血液中心 成分室，河南 郑州 450000)

新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma，FFP)最好在6 h(ACD保养液)或者8 h(CPDA保养液)内制备，2012年新的国家标准将FFP制备时间延长至18 h[1]，采血后8～18 h内制备出的FFP，用于制备冷沉淀凝血因子(简称冷沉淀)效果如何，目前说法不一[2-4]。冷沉淀含有丰富的凝血因子Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ，FⅧ)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)等，在临床被广泛用于血友病、手术后出血等的治疗。冷沉淀中的FⅧ不稳定，易受制备过程中时间、温度及制备方法等的影响，从而产生较大的质量差异，影响临床应用效果。为制备出高质量的冷沉淀，本研究选取采血后8 h内及8～18 h制备完成的FFP，分别采用全自动冷沉淀制备仪和低温融化箱两种设备进行冷沉淀的制备，探析不同制备方法对冷沉淀质量的影响及8～18 h内所制FFP制备冷沉淀的效果。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器所用试剂和仪器包括FⅧ活性测定试剂盒(希森美康，批号56500325)、Fib测定试剂盒(希森美康，批号547688)、全自动血凝分析仪(希森美康，型号CA-510)、大容量低温离心机(西格玛)、恒温摇摆式融化箱(CT-4T.6C)、冷沉淀制备仪(沃塘)、威高速冻机、河南省红十字血液中心智能一体化平台(唐山启奥科技有限公司)。

1.2 材料随机选取2019年12月至2020年1月郑州地区采集的400 mL全血(CPDA保养液)240袋，采集后冷藏保存，其中120袋于8 h内制备成FFP(A组)，120袋于8～18 h制备成FFP(B组)，离心条件为：温度2～6 ℃，4 100g，离心18 min。分离出每袋200 mL的血浆，速冻后保存48 h备用。

1.3 制备方法取出保存的A组和B组FFP，每组随机选取60袋采用恒温摇摆式水浴箱制备冷沉淀，60袋用全自动冷沉淀制备仪制备冷沉淀。

1.3.1恒温摇摆式水浴箱法 从低温冰箱中取出FFP，于室温下放置5 min后置于融化箱中，转移空袋置于融化箱外，启动融化箱，使箱体充满水，血浆袋完全浸泡于1～6 ℃水中，待血浆部分溶解后松开血浆导管夹，使融化的血浆通过虹吸效应进入空袋中。肉眼观察，当原血浆袋内白色絮状物剩余量相当于冷沉淀所需量时，关闭血浆导管夹，阻断虹吸，称重并将容量调整至40～50 mL，热合断开，将获取的冷沉淀迅速放入血浆速冻机中速冻后于-18 ℃以下保存。

1.3.2全自动冷沉淀制备仪法 从-18 ℃以下低温冰箱中取出FFP，于室温下放置3～5 min，将原料血浆放入全自动冷沉淀制备仪的称重盒称重后，将血浆袋置于1～6 ℃水浴槽融化，转移袋留在称重盒内，将血袋导管卡入导管夹，水浴槽中的冰冻血浆在融化过程中通过虹吸作用，从高位的血浆袋流至低位转移袋，当血浆袋中剩余重量达到预设值时，导管夹自动夹闭血袋导管，并通过声音报警及按钮亮灯提醒制备已完成。操作人员取出冷沉淀血袋和转移血浆袋，热合离断，粘贴产品标签，将冷沉淀放入全自动水平接触式血浆速冻机中速冻后于-18 ℃以下保存。制备过程中，通过采用智能一体化平台与冷沉淀制备仪进行对接，对全自动冷沉淀制备仪运行情况进行实时监控，设置关键项数据警戒线，可展示制备温度、制备人员、产品重量、制备时间及制备流程等，出现异常实时报警，提醒工作人员及时干预，并实时提取Shinow 9.0中冷沉淀制备的有效数据，对数据进行分析、展示。

1.4 检测方法将待检测的冷沉淀凝血因子置于37 ℃恒温水浴箱中，完全融化充分混匀后将袋内血浆挤入至与血袋相连的导管内，热合并断开导管，取导管中的样品，按照试剂盒说明书进行检测。

1.5 观察指标FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量、Fib含量符合率。

2 结果

2.1 采血后8 h内制备的FFP，采用制备仪与水浴箱制备的冷沉淀质量比较以采血后8 h内制备的FFP为原料，采用全自动冷沉淀制备仪和恒温水浴箱制备的冷沉淀均符合国家标准。制备仪组FⅧ含量符合率、Fib含量高于水浴箱组(P<0.05)，两组FⅧ含量、Fib含量符合率相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 A组制备仪与水浴箱制备的冷沉淀质量比较

2.2 采血后8～18 h内制备的FFP，采用制备仪与水浴箱制备的冷沉淀质量比较对于采血后8～18 h内制备的FFP，采用恒温水浴箱制备的冷沉淀部分符合国家标准，采用全自动冷沉淀制备仪制备的冷沉淀全部符合国家标准。制备仪组FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量、Fib含量符合率均高于水浴箱组(P<0.05)。见表2。

表2 B组制备仪与水浴箱制备的冷沉淀质量比较

2.3 A组与B组制备仪制备的冷沉淀质量比较根据冷沉淀制备仪制备结果，用A组FFP制备的冷沉淀FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量符合率高于B组(P<0.05)，两组Fib含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 A组与B组冷沉淀制备仪制备的冷沉淀 质量比较

3 讨论

冷沉淀是由FFP在1～6 ℃的条件下融化后，分离出来的白色絮状沉淀物，主要富含FⅧ、Fib等活性物质，由于纯度、浓度高等优点，已在临床广泛应用。冷沉淀的质量关乎临床输注和治疗效果，影响冷沉淀质量的因素很多，如制备方法、温度、时间、原料血浆等[5]，如何提高或保证冷沉淀的质量，国内外专家学者进行了多方面的探索。采血后，FⅧ含量随着时间推移不断减少，在冷链保证的前提下，18 h内制备的FFP，其FⅧ能达到质量标准要求，这是18 h内制备的FFP用于制备冷沉淀的主要依据[6]。

为制备出高质量的冷沉淀，近年来本研究团队一直致力于冷沉淀制备工艺、流程、方法方面的探索。2019年之前主要采用恒温水浴箱制备冷沉淀，利用虹吸原理，边融化边虹吸已融化的血浆至转移袋，最后剩余40～50 mL的沉淀物，即为冷沉淀。制备过程中，严密观察，优化流程，尽可能缩短制备时间，制备好的冷沉淀及时置入速冻冰箱，缩短室内放置时间，预防不稳定凝血因子衰减，由此有效保证冷沉淀的质量。但是，采用恒温水浴箱制备冷沉淀，操作人员需不断将冷沉淀取出观察，凭经验和主观感觉判断容量，容量过多时需重新放入继续融化，取、放血袋的操作，易导致血袋晃动，使已附着在冰浆上的有效成分被虹吸入冷上清血袋。另外，水浴箱各部分温度不均衡，制备过程中人为干扰较多，这些因素均会直接影响冷沉淀中FⅧ、Fib的含量和回收率[7-8]，而采用全自动冷沉淀制备仪可有效克服上述不足[9-10]。2019年，河南省红十字血液中心实现冷沉淀制备自动化、信息化，通过全自动冷沉淀制备仪与智能一体化平台进行对接，实时监控融化温度及血浆容量，记录和保存制备过程中的关键数据，让冷沉淀制备过程更加精准流畅。

为得到更直观的数据，给同行提供参考，本研究比较了全自动冷沉淀制备仪与恒温水浴箱制备的冷沉淀的质量。研究结果显示：对于8 h内制备的FFP，采用全自动冷沉淀制备仪与恒温水浴箱制备的冷沉淀均符合国家标准，但全自动制备仪制备的冷沉淀质量优于后者；对于8～18 h内制备的FFP，采用全自动冷沉淀制备仪制备的冷沉淀全部符合国家标准，而采用恒温水浴箱制备的冷沉淀仅部分符合国家标准。本研究结果表明，采用全自动制备仪制备冷沉淀效果优于恒温水浴箱，全自动制备仪制备冷沉淀的方式值得推荐。2012年，新的国家标准将FFP的制备时间延长到18 h，但以采血后8～18 h内制备出的FFP为原料制备的冷沉淀质量如何，文献报道较少。本研究比较了A组与B组冷沉淀的质量，结果前者FⅧ含量高于后者，两组Fib含量差异无统计学意义。以往的研究证实，FⅧ是一种不稳定因子，其活性会随着时间延长而显著降低，Fib虽比较稳定，但亦有文献报道其含量随着分离时间的延长呈下降趋势[11-12]，与本研究结果一致。

综上所述，为保证冷沉淀质量，采血后应尽可能在8 h内制备出FFP，且采用全自动冷沉淀制备仪制备的冷沉淀质量更佳。