胶质瘤与恶性脑膜瘤患者肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达及预后的关系分析*

叶勇强，刘胜华，田必正，何 森，郝建强，谢 飞△

1.四川省资阳市第一人民医院神经外科，四川资阳 641300；2.四川省三台县人民医院神经外科，四川绵阳 621100；3.重庆市铜梁区人民医院神经外科，重庆 402560

神经系统肿瘤种类较多，而神经上皮组织肿瘤在临床上发病率最高，并且其分类及分型较为复杂，神经胶质瘤就是其中一种，胶质瘤起源于神经胶质细胞，包括星形细胞肿瘤、少突胶质细胞肿瘤及混合性胶质细胞肿瘤等，恶性度较高[1-2]。脑膜瘤多位于大脑矢状窦和凸面旁，易导致偏瘫等神经系统损伤症状,病程较短,且水肿明显[2-3]。三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)是膜转运体ABC超家族成员，近年来被发现与多种良恶性肿瘤的发生、发展存在潜在关联，且其还参与了肿瘤的耐药[4]。胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)主要通过非胰岛素样生长因子依赖性和胰岛素样生长因子依赖性发挥生物学功能，能够调节细胞增生、血管生成及细胞迁移，与胶质瘤的发生、发展关系密切[5-6]。本研究针对胶质瘤与脑膜瘤患者肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达差异展开分析，并围绕其对预后评价的临床意义进行对比研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2018年6月在资阳市第一人民医院确诊为胶质瘤患者96例(胶质瘤组)及恶性脑膜瘤患者38例(恶性脑膜瘤组)作为受试对象。胶质瘤组中男54例，女42例；年龄为38～75岁，平均(56.57±18.32)岁。恶性脑膜瘤组中男23例，女15例；年龄为50～87岁，平均(68.45±17.93)岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。全部患者随访1年。纳入标准：(1)临床资料、病理学检查确诊为胶质瘤及恶性脑膜瘤的受试对象均于资阳市第一人民医院接受手术治疗；(2)在接受本研究前未接受过特殊的化疗及放疗；(3)接受本研究时不伴有颅脑外伤；(4)无其他长期的神经内科相关疾病病史。排除标准：(1)同时罹患其他器官系统恶性肿瘤或其他神经系统良恶性肿瘤及炎症；(2)各种原因不能配合本次研究及随访。所有患者及其家属均知情同意，并签署知情同意书。本研究经资阳市第一人民医院伦理委员会批准通过。

1.2仪器与试剂 鼠抗人ABCG抗体(美国Abcam生物公司，产品批号A-AJ1006a);IGFBP-2免疫组化试剂盒(福建中杉金桥生物技术有限公司，FREE-001);光学显微镜(北京世科信科学仪器有限公司，XSP-100SM)。

1.3方法 受试对象均接受手术治疗，术中留取肿瘤组织标本，采用免疫组化法检测96例胶质瘤患者和38例恶性脑膜瘤患者标本中ABCG2、IGFBP-2阳性细胞的表达，计算其阳性细胞百分率并划分等级。免疫组化法检测ABCG2蛋白表达水平。取制作好的4 μm组织切片，首先经二甲苯脱蜡后，以梯度乙醇脱水，自来水冲洗后磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，滴加抗原修复液0.01 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液，自然冷却后用PBS冲洗；以过氧化氢滴加，用来阻断内源性过氧化物酶15 min；用PBS冲洗后滴加20%正常羊血清室温下封闭30 min，倾去血清加鼠抗人ABCG抗体，工作浓度1∶30；按说明书完成测定，并进行结果判定。ABCG2的免疫结果判定：ABCG2主要在细胞膜表达，以细胞膜出现棕黄色高出背景色为阳性细胞。随机选取5个高倍视野，进行阳性、阴性细胞计数，阳性细胞百分率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。阳性级别分为3个等级：Ⅰ级阴性，阳性细胞百分率为0%；Ⅱ级阳性，阳性细胞百分率为>0%～10%；Ⅲ级强阳性，阳性细胞百分率>10%。

IGFBP-2检测严格按照免疫组化试剂盒说明书进行操作，方法同上。一抗为羊抗人 IGFBP-2单克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术公司)，工作浓度1∶400。在4 ℃下进行孵育过夜，用S-P即用型试剂盒染色。在光镜(北京世科信科学仪器有限公司，XSP-100SM)下出现胞质和胞膜粗细一致的棕黄色颗粒即为阳性。每张切片随机观察3个高倍镜视野，分别计数100个细胞，通过阳性肿瘤细胞的百分率分级：Ⅰ级阴性，见极少或无阳性肿瘤细胞(0%～<10%)；Ⅱ级阳性(+)，阳性细胞百分率10%～<30%；Ⅲ级阳性(++)，阳性细胞百分率30%～<60%；Ⅳ级强阳性(+++)，阳性细胞百分率≥60%。将ABCG2阴性和阳性患者作为低表达ABCG2组，将ABCG2强阳性患者作为高低表达ABCG2组。将IGFBP-2阴性和阳性(+)患者作为低表达IGFBP-2组，将IGFBP-2阳性(++)和强阳性(+++)患者作为高表达IGFBP-2组。研究随访受试对象1年，收集期间预后复发率和病死率，分析其与分级的相关性。并收集患者出现不良事件(死亡、神经功能中度缺损)的情况。

2 结 果

2.1受试对象肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达分布 胶质瘤患者与恶性脑膜瘤患者ABCG2的表达分布具有相似性，主要分布于肿瘤细胞的细胞膜，胞质也有少部分表达，为棕黄色，阳性表达细胞有沿血管分布的倾向，级别越高，阳性表达细胞越多。见图1。胶质瘤患者与恶性脑膜瘤患者IGFBP-2表达分布也具有相似性，在胞质和胞膜均有表达，为棕黄色，级别越高，阳性表达细胞越多。见图2。

注:A为胶质瘤患者肿瘤组织中ABCG2阴性免疫组化结果，B为胶质瘤患者肿瘤组织中ABCG2阳性免疫组化结果，C为胶质瘤患者肿瘤组织中ABCG2强阳性免疫组化结果；a为恶性脑膜瘤患者肿瘤组织中ABCG2阴性免疫组化结果，b为恶性脑膜瘤患者肿瘤组织中ABCG2阳性免疫组化结果，c为恶性脑膜瘤患者肿瘤组织中ABCG2强阳性免疫组化结果。

注:A为胶质瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2阴性免疫组化结果，B为C为胶质瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2阳性(+)免疫组化结果，C为胶质瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2阳性(++)免疫组化结果，D为胶质瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2强阳性(+++)免疫组化结果；a为恶性脑膜瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2阴性免疫组化结果，b为恶性脑膜瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2 Ⅱ级阳性(+)免疫组化结果，c为脑膜瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2阳性(++)免疫组化结果，d为脑膜瘤患者肿瘤组织中IGFBP-2强阳性(+++)免疫组化结果。

2.2两组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2阳性细胞百分率及分级比较 胶质瘤组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2总阳性率与恶性脑膜瘤组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2阳性细胞百分率及分级比较[n(%)]

2.3两组随访预后情况比较 胶质瘤组随访中复发率和病死率与恶性脑膜瘤组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组随访预后情况比较[n(%)]

进一步分析两组患者肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达与预后之间的关联，两组患者均可见与ABCG2、IGFBP-2表达阴性者比较，随着阳性细胞百分率的增加，患者复发率与病死率也逐级升高。见表3、4。

表3 两组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达与复发预后之间关系

表4 两组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达与病死预后之间关系

续表4 两组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2表达与病死预后之间关系

2.4两组患者不同ABCG2、IGFBP-2表达分布对预后的生存曲线分析 随访过程中，ABCG2高表达患者出现不良事件(死亡、神经功能中度缺损)的时间提前于ABCG2低表达患者(χ2=13.660，P<0.05)。见图3。随访过程中，IGFBP-2高表达患者出现不良事件(死亡、神经功能中度缺损)时间提前于IGFBP-2低表达患者(χ2=19.266，P<0.05)。见图4。

图3 不同ABCG2表达组患者预后情况的生存曲线

图4 不同IGFBP-2表达组患者预后情况的生存曲线

3 讨 论

胶质瘤与恶性脑膜瘤在神经系统肿瘤病理变化基础存在相似性，但治疗与预后不尽相同，临床上需注意鉴别诊断[7-8]。ABCG2作为一种转运蛋白，其表达和功能发挥与体内外环境因素密切关联，随着干细胞研究的深入，不少研究发现，其参与了干细胞特性S-P表型的形成，而且与多种恶性肿瘤的发生及肿瘤干细胞的多药抗性密切联系[9-10]。ABCG2也可使脑肿瘤干细胞处于未分化状态,从而促使胶质瘤的恶性增殖[11]。同时，通过ABCG2转运蛋白的功能排除有害物质对肿瘤干细胞的伤害，对这类细胞也具有保护作用[12]。IGFBP-2在脑中的合成部位主要位于脉络丛及微血管系统中[13-14]。多种中枢神经系统的恶性肿瘤患者均可见IGFBP-2表达上调，脑脊液中 IGFBP-2可作为诊断恶性中枢神经系统肿瘤的一个特异性标志物。此外，IGFBP-2 阳性表达与肿瘤的恶性程度相关,可以提示肿瘤，特别是胶质瘤的恶性发展过程[15]。

近年来，已有研究发现ABCG2可能会影响成年人短期和长期记忆、精神运动功能、睡眠质量和情绪[14]。而在胶质瘤患者中，当其遇到压力或情绪事件时，应激反应激活蓝斑神经元，导致ABCG2与杏仁核协同促进去甲肾上腺素能系统在海马体中的释放，从而加强了记忆形成。而IGFBP-2阻断了去甲肾上腺素与杏仁核、海马内β肾上腺素能受体的结合，从而影响这两个区域的功能[5]。高级神经功能是神经系统肿瘤预后观测的重要指标，ABCG2和IGFBP-2可以有效影响患者的记忆、情感等功能。

本研究结果发现，胶质瘤和恶性脑膜瘤组织中ABCG2和IGFBP-2其分布具有相似性，ABCG2多分布于细胞膜，且阳性细胞多沿血管分布，IGFBP-2多分布于细胞质和细胞膜中。胶质瘤组肿瘤组织ABCG2、IGFBP-2总阳性率与恶性脑膜瘤组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这可能与恶性脑膜瘤的侵袭性远低于神经胶质细胞瘤有关。生存分析曲线结果显示，ABCG2、IGFBP-2高表达患者出现预后不良事件的时间普遍提前(P<0.05)。研究表明，ABCG2在胶质瘤中的表达随着肿瘤恶性程度的升高而逐渐上调，IGFBP-2 的表达在胶质瘤和其他肿瘤类型中随着肿瘤级别的增高而上调[16-19]。本研究同样证实了这点，在ABCG2和IGFBP-2阳性细胞百分率较高的患者中，其肿瘤恶性程度可能也比较高，复发和病死情况也较多。提示随着ABCG2和IGFBP-2阳性细胞百分率的增加，胶质瘤和恶性脑膜瘤患者的预后均更差。本研究发现，ABCG2和IGFBP-2对术前胶质瘤和恶性脑膜瘤的恶性程度具有预测价值，并联合影像学检查综合判断，有助于术中对病变性质、切除范围大小的判断，对临床早期评估预后具有一定作用，但其具体的生物学功能和机制尚有待进一步研究，可延长随访时间，增加样本量，对ABCG2和IGFBP-2两项指标的远期预测效能进行评估，减少混杂因素的影响，以期更进一步说明ABCG2和IGFBP-2两项指标的预测价值。