炎症微环境下低强度高频振动对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

白坤宏 向婷 赵敏越 卜雯卿 程政 王菲

[关键词]炎症环境;振动;牙周膜干细胞;成骨分化;牙周病;蛋白水平

牙周病是我国发病率最高的口腔慢性疾病之一，长期的牙周病可以造成牙周支持组织的损伤、缺失，包括牙龈红肿出血、牙龈退缩、牙槽骨吸收等，最终导致牙齿松动、脱落[1]。牙周支持组织的自身修复能力较弱，并且持续处于炎症微环境之中，使得丧失的牙周支持组织难以再生。牙周组织工程技术为牙周缺损开辟了新的治疗途径。牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）相较其他干细胞表现出更强的牙槽骨、牙周韧带重建能力，被认为是最理想的牙周组织工程种子细胞[2]。

低强度高频振动（Low magnitude high frequencyvibration，LMHFV）是一种新颖的机械力学辅助疗法，以其非药物性、非侵入性的优势，被应用于肥胖、骨质疏松、肌肉疲劳、骨折等疾病的临床研究与康复治疗之中，并且取得了不错的效果[ 3 - 5 ];在干细胞研究领域也有学者证实LMHFV对骨髓间充质干细胞（Bone m a r r o wmesenchymal stem cells，BMSCs）、PDLSCs的增殖、分化有相应的作用[6-7]。目前尚无LMHFV在炎性条件下对PDLSCs成骨性能影响的相关报道，所以本课题组就LMHFV在炎性条件下对PDLSCs成骨分化能力的作用展开探索，为今后将LMHFV应用于牙周组织工程技术奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料：αMEM培养基（Hyclone，美国）;胎牛血清（Gibco，美国）;Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液（索莱宝，北京）;重组人TNF-α、重组人IL-1β（PeproTech，美国）;β甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸、Trizol Regent（Invitrogen，美国）;PrimeScriptTM RT-PCR kit 反转录试剂盒、Syber Green荧光定量PCR试剂盒（Takara，日本）;Z45CT垂直振动机（广州美亦丰试验设备有限公司）;CO2恒温培养箱、酶联免疫检测仪（Thermo，美国）;RealTime PCR仪（Biosytems 7500，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 PDLSCs的分离培养：选取年龄为12～18岁正畸治疗需要拔除的前磨牙，用含1%三抗的PBS将离体牙牙根冲洗干净，用解剖刀片搔刮牙根根中1/3获得牙周膜碎片，离心后，在牙周膜沉淀中加入3mg/ml Ⅰ型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶各500μl，37℃消化30min。等体积含10%胎牛血清（FBS）的αMEM培养基终止消化，1 000r/min离心5min，弃上清。加入含10% FBS的αMEM培养基重悬，接种于培养瓶，于37℃、5% CO2条件孵箱培养。原代细胞汇合达80%时传代培养。

1.2.2 PDLSCs间充质干细胞表面标志物检测：取P3代的PDLSCs，以1×106个/毫升并移入1.5ml EP管，每管200μl;依次向EP管中加入2μl荧光标记的抗体（CD34、CD45、CD90、CD146、STRO-1），4℃避光孵育1h，PBS冲洗3次，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况。

1.2.3 构建体外炎症微环境与体外LMHFV模型：通过参考同研究领域学者的实验方法[8-9]，选择在常规培养液（含10% FBS的α-MEM培养液）中添加TNF-α（10ng/ml）与I L - 1 β （ 5 n g / m l ） 配制成炎性培养液， 以此构建体外炎症微环境。采用广州美亦丰Z 4 5 C T 垂直振动机（见图1），该装置由控制台与振动台构成，可以产生5～500Hz正弦振动波。进行细胞加力实验时，通过控制台设置振动参数，将细胞培养板固定于振动台，进行细胞加力。根据本课题组前期的预实验，调整振动参数为：加速度=0.3g，频率=40Hz，时间=15min/d时，P D L S C s 的成骨分化能力提高最为明显（ 见图2 ） ， 因此选择这一参数构建LMHFV环境。实验分组：Control组（0 H z，常规培养液培养）;LMHFV组（40Hz，常规培养液培养）;Inflammation Microenvironment（IM）组（0Hz，炎性培养液培养）;IM+LMHFV组（40Hz，炎性培养液培养）。

1.2.4 Rea l t i m e RT-PCR检测成骨相关基因表达;取第4代细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞汇合至6 0 %，根据实验分组更换成骨诱导液（含10% F B S 的α-MEM培養基，加β甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸5 0 g / m l、地塞米松1×1 0 m o l / L）进行成骨诱导;炎性成骨培养液需在常规成骨培养液的基础上添加1 0 n g / m lT N F - α 与5 n g / m l IL-1β）。换液后2h将6孔板固定于Z45CT垂直振动机振动台上，根据分组设置振动参数，每组均加力15min/d（0Hz组在振动台上静置15min/d），连续加力7d;期间每3d换液，每次2ml;在最后一次振动结束后2h终止培养，使用Trizol试剂提取细胞总RNA;控制RNA浓度在300～500ng/μl，A260/A280为1.8～2.0。使用PrimeScriptTM RT-PCR kit逆转录试剂盒合成cDNA，使用Syber Green荧光定量PCR试剂盒进行qPCR检测。实验所用引物序列见表1所示。

1.2.5 Western-Blot检测成骨相关蛋白表达：取P4代的PDLSCs，以1×105个/孔接种于6孔板，待PDLSCs汇合至70%左右，根据实验分组更换成骨诱导液进行成骨诱导;换液后2h将6孔板固定于Z45CT垂直振动机振动台上，根据分组设置振动参数，每组均加力15min/d（0Hz组在振动台上静置15min/d），连续加力7d;期间每3d换液，每次2ml;在最后一次加力后12h终止培养，提取总蛋白，经BAC蛋白定量试剂盒对样品进行检测定量，按30μg/20μl体系加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min，置于-80℃冰箱待用。制备SDS-PAGE胶，依照蛋白分子量大小进行电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，洗膜后加入一抗，4℃静置过夜。次日洗膜后加入二抗，于室温摇床孵育2h，洗膜后于暗室中将ECL荧光剂均匀浸湿膜表面，最后进行显影定影及曝光。

1.2.6 茜素红染色检测：连续加载LMHFV并成骨诱导21d进行茜素红染色（茜素红染液：1g茜素红溶于100ml蒸馏水，pH=4.3），弃6孔板培养液，蒸馏水冲洗2遍，60%异丙醇固定，茜素红染液染色5min，蒸馏水冲洗，观察并采用酶标仪检测450nm波长的吸光度（A）值。

1.3 统计学分析：采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行统计学分析，t 检验分析数据，P <0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PDLSCs间充质干细胞表面抗原标志物鉴定：流式细胞仪检测结果显示，PDLSCs阳性表达间充质干细胞表面标志物CD90、CD146、STRO-1，阴性表达造血系来源细胞表面标志物CD34、CD45。见图3。

2.2 成骨相关基因表达情况：Realtime RT-PCR结果显示：与IM组相比，IM+LMHFV组的RUNX-2、ALP、COL-1相对表达量均有上升，差异具有统计学意义（P<0.05）;而OCN的相对表达量虽然有升高趋势，但差异不具有统计学意义（P >0.05）;上述两组与Control组相比，成骨基因相对表达量均有明显减低，差异有统计学意义（P <0.05）。见图4。

2.3 成骨相关蛋白表达结果：Western-blot结果表明：与IM组相比，IM+LMHFV组ALP、COL-1、OCN的蛋白表达量均有提高，差异具有统计学意义（P <0.05）;而RUNX-2虽然有增高的趋势，但差异不具有统计学意义（P >0.05）;上述两组与Control组相比，成骨标志物的蛋白表达量均有显著下降，差异有统计学意义（P <0.05）。见图5。

2.4 茜素红染色结果：I M组几乎观察不到有钙结节生成， 而I M + L M H F V 组有少量红染的钙结节; 与C o n t r o l组比较， I M 组和I M + L M H F V 组的钙结节生成量显著减少;通过对染色结果进行半定量分析，提示IM+LMHFV组细胞基质钙含量较IM有所增多，但差异无统计学意义（P >0.05）。见图6。

3 讨论

慢性牙周炎患者接受牙周基础治疗之后炎症反应虽然得到控制，但是缺损区域的牙周组织仍然处于炎症微环境之中，并且相较健康人群，这些患者对牙周致病菌具有更强的易感性，炎症反复几率大大增加，而炎性环境会削弱牙周各组织的修复再生能力。根据慢性牙周炎的形成机制，学者们主要通过三种方法在体外模拟牙周炎症微环境，即：培养液中添加Pg.LPS[10-11]、培养液中添加炎性细胞因子[9，12]、直接从牙周病离体牙的牙根获取炎性来源牙周膜干细胞（PDLSCs from periodontitis tissue，pPDLSCs）[13]。Park等[14]的研究已证实pPDLSCs与健康组织來源的牙周膜干细胞（PDLSCs from healthy periodontaltissue，hPDLSCs）相比表现出炎症反应刺激后的细胞特性的变化，包括增殖、多向分化等能力的改变;但是提供pPDLSCs的志愿者年龄一般较大，并且几乎不能同时提供hPDLSCs，这影响了实验的可行性;如果使用不同年龄、不同个体来源的两种PDLSCs进行实验，又增加了实验的干扰因素，所以这种体外炎症模型的构建方法还存在争议。通过应用Pg.LPS模拟炎症模型也是常用的体外建模方法，其效果获得一些学者的认可，但是受到Pg.LPS刺激后所产生的细胞反应十分复杂，涉及到的信号通路较多，这可能会影响到实验后续的机械力学刺激。IL-1β与TNF-α是牙周病进展过程中发挥主要作用的炎症介质，两者均会促进胶原酶等基质溶解酶的分泌，加速牙周纤维组织降解，造成附着丧失;与此同时IL-1β与TNF-α还是破骨细胞增殖、活化的刺激因子，可以激活破骨细胞，造成牙槽骨吸收;所以本实验选用IL-1β与TNF-α构建体外炎症微环境，旨在更为准确地模拟牙周炎症反应。

LMHFV已经被证实可以提高BMSCs的成骨分化能力[15]，而且在本实验前期的研究当中也证实其可以促进PDLSCs成骨相关基因的表达，但尚未有报道证实在炎性条件下LMHFV是否会增强或阻碍PDLSCs的成骨分化能力。因此，本实验通过炎性细胞因子IL-1β和TNF-α模拟体外炎症微环境，并应用前期实验摸索的最适振动参数对PDLSCs施加LMHFV刺激，探究炎性条件下LMHFV对PDLSCs成骨分化能力的作用。Runt相关转录因子-2（runt-related transcriptionfactor-2，RUNX-2）是Runt（Runt domain）转录因子家族中的一份子，是骨组织成熟过程中不可或缺的转录因子[16]。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是骨组织形成、代谢过程中重要的矿化调节物，其主要的作用是在骨形成过程中水解磷酸酯和破坏矿化阻断剂从而促进基质矿化反应，并且ALP可同时作为钙结合蛋白和磷酸基转运子促进矿化[17-18]。Ⅰ型胶原（Collagen typeⅠ，COL-1）是人和动物体内骨组织与纤维组织细胞外基质的主要成分，在矿化的骨组织中COL-1是仅有的胶原成分，具有维持骨组织形态结构的作用;并且有研究证实COL-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化[19-20]。骨钙素（Osteocalcin，OCN）是一种非胶原蛋白，只有分化成熟的成骨细胞可以特异性的合成并分泌OCN。本实验在炎症微环境下对PDLSCs施加LMHFV刺激，7d后通过Realtime RT-PCR与Western-blot对成骨相关标志物RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的mRNA表达及蛋白表达进行检测，结果均表明LMHFV能够在炎性条件下增强PDLSCs的成骨分化能力。这一结果与Kim等的动物实验结果接近，该实验对Balb/C小鼠注射LPS建立炎症骨吸收动物模型，并让其中一部分小鼠接受全身振动刺激（加速度=0.4g，频率=45Hz），结果发现接受振动刺激小鼠的胫骨、腓骨的骨量与骨密度明显高于单纯注射LPS的小鼠;在进行机制研究时还发现在LPS诱导的炎性环境下，微振动可以降低BMSCs对破骨相关基因IL-1β、TNF-α以及巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage Colony stimulating Factor，M-CSF）的表达[21]。茜素红染色结果显示：炎症微环境下LMHFV刺激后PDLSCs生成的钙结节略有增多;而对染色结果进行半定量分析后发现，炎症微环境下LMHFV并未显著增加PDLSCs的钙结节合成量，仅有略微增多的趋势。茜素红染色的结果与染液的pH值、细胞固定的时间、水化的时间等因素均有关联，其中任何一项的偏差均会影响实验的结果，因此成骨染色实验的结果还需进一步验证。

炎性条件下，PDLSCs的多向分化潜能受到影响，成骨分化能力会遭到抑制。在本实验中，炎症微环境下培养的PDLSCs成骨相关标志物的检测结果相较常规培养者均有显著降低;虽然经过LMHFV刺激后，成骨相关标志物的表达量会有不同程度的升高，但是与常规培养者相比，RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的表达仍然不及正常培养的PDLSCs，茜素红染色的结果与此相一致。这一结果与Kim等的体内实验结果也接近，虽然微振动刺激可以修复LPS造成的骨量和骨密度降低，但相较空白对照组的小鼠仍有明显不足。这说明，在炎症微环境下LMHFV刺激虽然可以一定程度上提高PDLSCs的成骨分化能力，但是并不能完全抵消炎症对成骨分化的抑制作用。

综上所述，本实验着重探讨了炎症微环境下LMHFV对牙周组织工程种子细胞成骨分化能力的影响，这只是将LMHFV应用于牙周组织工程的最初期探索，在后续的动物实验中，还需要研究不同的生物支架材料对振动的传导性，以及LMHFV是否会使生物支架材料自身结构发生改变。此外，进行体内实验时，牙周炎症环境周围可能会有破骨细胞的存在，而LMHFV对破骨细胞的作用尚未可知，也需要开展相关的研究。而且生物支架材料包裹种子细胞植入动物体内后，PDLSCs受到的振动频率、振幅等可能会与局部振动装置的参数不同，所以体内实验所应用的振动参数包括加速度、频率、时间等均需要进一步探索。