基于转录组和代谢组分析马齿苋根茎叶中类黄酮代谢

张少平，邱珊莲，黄惠明，张 帅，林宝妹，洪佳敏，郑开斌

(福建省农业科学院 亚热带农业研究所，福建漳州 363005)

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为马齿苋科一年生草本药用植物，其广泛分布于世界各地，尤以热带或亚热带地区居多[1-2]。在中东、南亚及中欧等地，马齿苋嫩茎叶常被用于野菜或调料香草食用[3]。马齿苋被列为药食同源植物[4-5]，具有清除自由基、预防冠心病以及保肝、抗菌、抗炎等功效，同时具有抗病毒、抗癌活性和减轻多种疾病等作用[6-8]。马齿苋富含类黄酮、多糖、萜类、生物碱、甾醇、脂肪酸、维生素及矿物质等活性成分[9-10]。类黄酮为马齿苋的重要功效成分[11]，由于类黄酮所具有的特殊功效，近年来已引起广泛关注[12-14]。目前，已报道植物中所含类黄酮种类达4 000种，主要分为黄酮(如芦丁、木犀草素和芹菜素等)、黄酮醇(如山奈酚、杨梅素、槲皮素、柽柳黄素和漆黄素等)、黄烷酮(如柚皮素、柚皮苷、橙皮素和紫杉叶素等)、异黄酮(如染料木苷和大豆苷等)和花青素(如天竺葵素和矢车菊素等)等六大类[15-17]。类黄酮合成代谢途径主要包括苯丙氨酸代谢途径、类黄酮合成代谢关键反应以及各种花青素的合成与修饰等阶段[18]，所涉及的主要合成酶包括查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、花青素合成酶/无色花色素双加氧酶(ANS/ LDOX)以及类黄酮3-O-糖基转移酶(UF3GT)等[19]。

马齿苋作为药食同源植物一直广受关注，关于马齿苋的人工栽培、相关成分测定、营养保健及药理功效等相关研究都有较为详细的研究报道[3]。在马齿苋类黄酮相关研究方面，目前已报道马齿苋不同组织中所含的类黄酮有黄酮醇(山奈酚、杨梅素和槲皮素)、黄酮(芦丁、木犀草素和芹菜素)、异黄酮(染料木黄酮和染料木苷)以及马齿苋黄酮醇A、马齿苋黄酮醇B、马齿苋黄酮醇C和马齿苋黄酮醇D等[3,11]。然而马齿苋不同品种或同一品种不同组织中所含类黄酮种类及其含量存在差异[20-21]。此外，目前还未见马齿苋类黄酮合成代谢途径中相关合成酶的报道。因此，本研究拟以马齿苋根、茎和叶为研究对象，利用代谢组结合转录组进行分析，通过不同数据库注释后再进行类黄酮成分及其合成酶等关键词检索并进行归类。同时挑选部分参与类黄酮合成的酶差异表达基因进行荧光定量PCR(qRT-PCR)验证分析，为进一步从事马齿苋类黄酮合成代谢相关分子生物学研究打下良好基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验材料马齿苋为福建省闽南地区常见的红茎、绿叶和白色根部的野生种，前一年秋季采收种子后，于第二年春季播种于福建省农业科学院亚热带农业研究所国家闽台特色作物种质资源圃内，待夏季开花后，采收马齿苋根、茎和叶各6份，用75%酒精洗净后分别转入2.0 mL离心管，于-80 ℃冰箱保存备用。实验研究时，取保存备用的马齿苋根、茎和叶各3份通过提取后进行代谢组学分析；另外各3份通过提取后进行转录组测序分析及进一步进行相关基因qRT-PCR验证。

1.2 方 法

1.2.1 代谢组学分析取马齿苋根、茎和叶3次重复共9个样本进行代谢组分析。(1)样品提取：首先，将样品放入冻干机(Scientz-100 F)中进行真空冷冻干燥；冻干样品利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末状；称取100 mg粉末，溶解于0.6 mL 70% 甲醇提取液中，于4 ℃冰箱过夜，期间涡旋6次，以提高提取率；离心(转速10 000 g，10 min)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22 μm pore size)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析。(2)UPLC分析：色谱柱(1.8 μm,2.1×100 mm)A相流动相为超纯水(加入0.04%的乙酸)，B相流动相为乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脱梯度中0～10 min为5%～95% B；10～11 min为95% B，11～11.1 min为 95%～5% B，11.1～14 min为5% B。(3)MS/MS条件：电喷雾离子源(ESI)温度550 ℃，质谱电压5500 V，帘气(CUR)30 psi，碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高。在三重四级杆(QQQ)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测[22]。

1.2.2 类黄酮相关成分筛选马齿苋相关样品提取后，通过UPLC结合MS/MS分析，基于百迈客科技有限公司所建数据库MWDB(metware database)，根据二级谱信息进行马齿苋根、茎和叶各3个样品中的类黄酮相关成分进行定性和定量分析。

1.2.3 转录组测序采用Trizol法提取马齿苋根、茎和叶3个部位3次重复共9个样本总RNA，各自取等量混合组成RNA池，通过磁珠富集、mRNA反转录形成cDNA、连接测序接头、文库构建以及PCR富集样本后，进行Illumina HiSeqTM 2500平台转录组测序，所获取的原始数据在剔除人工接头序列和低质量读序等过滤后，干净读序再进行组装即获得马齿苋根、茎和叶组织中的单基因簇(unigene)库。进一步进行单基因簇随机性和饱和度检验等测序文库质量评估，合格的数据再进行表达量(FPKM)分析及采用Blast软件[23]进行相关数据库功能注释分析。

1.2.4 参与类黄酮合成的酶基因筛选所有数据库获取马齿苋根、茎和叶单基因簇相关信息后，再进行参与类黄酮合成的酶(CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS、 LAR、 ANR、FLS、FSI/FSII、F2H、IFR、HID、UF3GT)相关基因检索。同时，根据相关单基因簇FPKM值，进行热图分析。

1.2.5 差异表达基因qRT-PCR分析根据转录组测序结果中FPKM值，选取在马齿苋根、茎和叶中差异表达的6个参与类黄酮合成的酶基因进行qRT-PCR检测。取每个样品总RNA各500 ng(转录组测序过程中所保存RNA)，采用超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100)检测RNA的OD值，使用A260/A280比值判定RNA纯度。合格的RNA采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)进行反转录操作，采用20 μL体积，根据反转录试剂盒中反应体系和反应条件合成cDNA，同时进行6个参与类黄酮合成的酶基因引物合成(表1)，通过程序及体系构建以进行qRT-PCR反应。

表1 荧光定量PCR分析的7个基因及所合成的引物

2 结果与分析

2.1 代谢组分析马齿苋相关成分

选取马齿苋根、茎和叶3组，设3个生物学重复共9个样品，进行代谢组分析。基于UPLC-MS/MS检测平台和百迈客科技有限公司所建数据库，共检测到401个代谢物。其中类黄酮、脂类、酚酸、氨基酸及其衍生物、生物碱、有机酸等次生代谢产物所含的化合物种类较多，分别有32种、69种、63种、59种、43种和36种；类黄酮在茎部含量高于叶和根部，而脂类、酚酸、生物碱等成分在茎部含量低于叶和根部(表2)。

表2 马齿苋根、茎和叶片中代谢产物具体成分、数量及含量的平均值

2.2 类黄酮相关成分分析

根据代谢组所获取的代谢产物，进一步进行类黄酮相关成分分析。结果表明，马齿苋根、茎和叶中皆含有类黄酮中异黄酮、黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇和花青素等6类二级代谢产物，这6类二级代谢产物所含化合物分别有3种、8种、11种、3种、5种和2种(表3)。

表3 马齿苋中类黄酮成分

进一步进行这32种化合物在马齿苋根、茎和叶(各3个重复)共9个样品中的相对含量分析表明，马齿苋类黄酮化合物在茎和叶的总体含量较根部更接近。此外，黄酮(pmb0678)等20种类黄酮化合物在马齿苋根、茎和叶部含量接近，其中黄酮(pmb0678)、花青素(pme1398)和异黄酮(mws0089)等类黄酮化合物总体含量较低，黄酮(p6273 和pmb0736)和黄酮醇(pmn001642)等类黄酮化合物总体含量较高；而黄烷酮(mws0024)等12种类黄酮化合物在马齿苋根、茎或叶中含量差异明显，除黄酮(mws1608)和黄烷酮(N5362)在马齿苋根部含量相对较高外，其他10个类黄酮化合物在马齿苋根部含量均很低。此外，异黄酮(pmp000550)和黄烷醇(pmb2979) 等类黄酮化合物在茎和叶部总体含量较高，并以异黄酮(pme1587)和黄酮(pmn001668)等类黄酮化合物在叶部含量最高。

2.3 转录组测序结果

进行马齿苋转录组测序，共获得58.89 Gb的干净数据，所有根、茎、叶3组和3个生物学重复共9个样本的数据均高于5.99 Gb。测序碱基Q30大于93.25%。干净数据经组装后共获得57 485条单基因簇，其中单基因簇长度大于1 kb的有18 358条。

所有单基因簇经8个数据库比对(表4)，共有24 821条注释到了相关信息，其中注释到信息的单基因簇长度大1 000 bp的有15 220。此外，在所有数据库中，NR注释到单基因簇相关信息最多，达24 579条，其中300～1 000 bp的有9 395条，大于1 000 bp的有15 184条。

表4 不同数据库所注释到相关单基因簇数量

2.4 参与类黄酮合成的酶基因分析

所注释到信息的24 821条单基因簇中，进一步进行类黄酮合成相关酶基因检索，获得11种共93条类黄酮相关信息(表5)，其中基因家族数量较多的有UF3GT、F3′H、CHS和IFS，分别有22条、21条、20条和11条；基因家族数量较少的有LAR，只有1条，其他较少的有ANS、F3′5′H、DFR和ANR，各具有2条。

表5 马齿苋中类黄酮主要合成酶基因

进一步进行该93条类黄酮单基因簇在马齿苋根、茎和叶(各3个重复)共9个样品中的相对表达量热图分析表明(图1)：参与马齿苋类黄酮合成酶基因在茎和叶的总体表达量较根部更接近。此外，大多数参与类黄酮合成的酶基因在马齿苋根、茎和叶部的表达量接近，只有少量基因的表达量存在较大差异，如编码为c68208.0和c36394.0等基因簇在根部的表达量显著低于茎和叶；编码为c50150.0的基因簇在叶部的表达量显著高于茎和根。同时，一些单基因簇如c66990.1、c81701.0和c50458.0等在重复的根或茎部位表达量存在较大差异，因此，在取相关数据进行参考时，应尽量选取同一部位3个重复样品中其中较为一致的2个数据进行参考，这样更接近真实数值。

图1 类黄酮主要合成酶在马齿苋根、茎和叶片中的相对表达量Fig.1 The relative expression in root,stem and leaf of P. oleracea

2.5 差异表达基因qRT-PCR分析

挑选在马齿苋根、茎和叶转录组测序中FPKM值差异表达的6个参与类黄酮合成的酶(表6)，进行qRT-PCR实验。结果表明，上述6个参与类黄酮合成的酶基因在马齿苋根、茎和叶中的上下调表达趋势与转录组FPKM值结果一致。其中，F3H (C71132.1)、F3′H(c 73076.0)和IFS (C72466.0)在根部表达量最高；CHS(C65410.1)和CHI (C72950.0)在茎中的表达量最高；UF3GT(C67021.1)在根部表达量较低，在茎和叶中表达更高(图2)。

图2 6个差异表达基因在马齿苋根、茎和叶片中的表达量趋势Fig.2 The expression trend of 6 differential genes in root,stem and leaf of P. oleracea

表6 荧光定量PCR分析马齿苋根、茎和叶片中6个差异表达基因

3 讨 论

类黄酮为植物次生代谢产物中重要的化合物，关于类黄酮成分及其合成代谢酶基因一直是研究的热点。在类黄酮相关成分研究方面，目前已报道植物中所含类黄酮种类达4 000种[17]，其中马齿苋中所含类黄酮有12种[3,11]。而本研究通过高效液相色谱结合质谱进行马齿苋类黄酮相关成分分析，共获取马齿苋中6大类32种类黄酮化合物，同时，进一步明确指出己糖基芹菜素阿魏酰己糖苷、麦黄素7-O-己糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸苷等 20种类黄酮化合物在马齿苋根、茎和叶部含量接近；而另外12种在根、茎和叶等不同部位含量差异明显的类黄酮化合物中，毛蕊异黄酮苷和橙皮素邻丙酰己糖苷等类黄酮化合物在茎和叶部总体含量较高，大豆苷元-7-O-葡萄糖醛酸苷和芹黄素-3-O-α-L-鼠李糖甙等类黄酮化合物在叶部含量最高。因此，相较于已报道关于马齿苋类黄酮相关文献[3,11]，本研究极大地丰富了马齿苋类黄酮相关化合物成分，为进一步进行马齿苋不同部位类黄酮相关成分提取利用等打下了良好基础。

由于目前还未见马齿苋类黄酮合成代谢相关酶基因的具体分析，因此，本研究通过转录组测序，获得单基因簇信息后，根据已报道其他植物中类黄酮合成代谢所涉及的相关合成酶，进一步进行马齿苋中相关基因检索，获得11类共93条类黄酮相关合成酶单基因簇信息。同时，根据相关单基因簇的FPKM值，进行基因热图分析，获得在马齿苋根、茎和叶差异表达明显参与类黄酮合成的酶基因。因此，本研究不仅丰富了马齿苋类黄酮合成代谢相关酶基因信息，同时为进一步进行马齿苋参与类黄酮合成酶基因的克隆及转基因利用等打下良好基础。

同时，在类黄酮化合物含量及参与类黄酮合成的酶表达量共2个热图分析方面：马齿苋类黄酮化合物在茎和叶的总体含量较根部更接近，其参与类黄酮合成的酶基因相对表达量同样也是茎和叶较根部更接近。此外，所有类黄酮化合物含量在重复试验的根、茎或叶部存在差异不明显，属于正常误差范围，所以数据处理相对简单；而大多数参与类黄酮合成的酶基因在马齿苋根、茎或叶部重复试验中的表达量接近，但UF3GT(C62969.0和C58863.0)、 F3′H(C65171.0)和 LAR等少量基因表达量在不同部位重复试验中存在较大差异，这主要是因为部分基因表达量极低或有些基因非常敏感，所以在样品采集、RNA提取及反转录等进行转录组测序前期过程中导致产生误差。因此，对相关数据进行参考时，应选取重复样品中其中较为一致的2个数据，这样更接近真实数值。

本研究选取6个参与类黄酮合成的酶基因进行qRT-PCR实验，该结果在马齿苋根、茎和叶中的上下调表达趋势与转录组FPKM值结果一致，因此，该结果进一步证明了转录组测序结果真实可靠。