转彩色马铃薯StAN1基因的烟草幼苗耐旱性分析

鲍燕如，聂腾坤，王冬冬，陈 勤

(1 西北农林科技大学 农学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵 712100；2 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵 712100)

马铃薯(Solanumtuberosum)是茄科一年生草本作物，其中富含多种花青素，具有很好的营养价值和保健价值[1]，有利于预防和治疗一些癌症以及一些心血管疾病[2-3]，是世界范围内重要的粮食作物之一。马铃薯在温暖和寒冷的环境中都可以生长，但不耐旱。在整个生育时期都容易受到干旱胁迫[4]，从而导致产量下降。

随着全球气候变化，选择耐旱抗旱的马铃薯品种对于全球粮食安全至关重要[5]。干旱胁迫是农业生产中最常见的非生物胁迫，而且植物对于这些胁迫的初始反应都是相似的，由于水分不足以及活性氧的积累进而抑制了植物的生长和发育[6]，在农业生产上造成大规模的减产。因此，提高植物的耐旱性是应对全球气候变化较为行之有效的方法与措施[7-8]。LEA蛋白最早在棉花(Gossypiumhirsutum)种子中发现，在种子成熟后期大量合成，因此被称为胚胎发育后期丰富蛋白。随后，研究人员陆续从大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)等作物中也发现了这类蛋白。LEA蛋白除了在种子成熟后期表达外，在植物受到不同程度干旱胁迫时也会大量表达，是由于LEA蛋白中的氨基酸赋予其较好的亲水性，在应对干旱等非生物胁迫时能有效保持水分[9]。而AP2/ERF类转录因子调控植物的生长并广泛参与植物的次生代谢[10-11]，植物自身次生代谢产物的积累能够有效地调控植物应对生物或者非生物胁迫[12]。

花青素是一类重要的黄酮类次生代谢产物[8]，相对于其他类黄酮物质具有更高的抗氧化性，由于其含有带正电荷的氧原子，清除活性氧的能力更强，能有效防止细胞膜脂过氧化，减少活性氧对植物的损伤，提高植物在干旱胁迫下的存活率[13]。彩色马铃薯中富含多种花青素，参与多种生化反应过程[14]，如生物胁迫、植物激素运输以及不同器官色素沉积，在干旱所导致的非生物胁迫中，花青素还可以有效清除活性氧，保持细胞稳态环境[15]。花青素表达受MYB转录因子(TFs)、碱性螺旋-环-螺旋(bHLH) TFs和WD40蛋白复合体(MYB-bHLH-WD40‘MBW’复合物)的控制[16-17]。StAN1基因是R2R3 MYB基因家族调控彩色马铃薯花青素合成的一个基因，在调控花青素合成过程中发挥重要作用[18-19]。因此，本研究探讨了转StAN1基因烟草在应对干旱和高温胁迫时的反应，为进一步了解彩色马铃薯StAN1基因功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

试验材料为本氏烟草(Nicotianatabacum)及过表达StAN1转基因烟草的稳定株系，均由本实验室保存并提供。

试剂MS培养基(Murashige & Skoog)购于美国Phytotech公司，植物组DNA、RNA提取试剂盒以及荧光定量试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司，2×Taq PCR StarMix购于北京康润诚业生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯，购于广州市华大化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 转StAN1基因烟草PCR检测用DNA提取试剂盒提取T4代转StAN1基因烟草的DNA。用鉴定引物进行PCR扩增，反应体系50 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各2.5 μL(10 mmol/L)，ddH2O 18 μL，2×Taq PCR StarMix 25 μL。反应程序为：94 ℃预变性7 min；94 ℃变性30 s；51 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

鉴定引物为StAN1ox-F(5′-ATGACTTCACATGTAATGATCA-3′) 和 StAN1ox-R(5′-TTA-ATTAA GTAGATTCCATATATCA-3′)。

1.2.2 转StAN1基因烟草qRT-PCR检测提取PCR结果为阳性的烟草总RNA，按照天根反转录试剂盒进行反转录，参照天根荧光定量试剂盒说明书，以20 μL 体系进行实时荧光定量检测转基因烟草。特异性引物为actin-F(GCTTTCTTCGTCCCATCA)和actin-R(CCCCAAGTACCCTCGTAT)；StAN1-F(GCAAGCCAATGCCATAATAAGA)和StAN1-R(ATTCATCCCAACCACCATCACC)。

1.2.3 转StAN1基因烟草花青素含量测定采用pH示差法测定叶片中的花青素含量[20-21]，取0.1 g烟草叶片，液氮研磨后，用2 mL 70%乙醇提取，10 000 r/min离心15 min，取500 μL上清液，分别用pH1.0和pH4.5的缓冲液稀释4倍，40 ℃平衡30 min，用紫外分光光度计分别于525和700 nm测定吸光度值。

花青素含量(mg/g)=[(A525-A700)pH1.0-(A525-A700)pH4.5]×MW×DF×1 000/(ξ×m)

公式中A为吸光度值，MW为矢车菊素葡萄糖苷相对分子量449.2，DF是稀释倍数，ξ是矢车菊素葡萄糖苷摩尔消光系数26 900，m为样品的质量。

1.2.4 植物材料处理过表达StAN1基因的烟草种子和野生型烟草种子，经过10%次氯酸钠消毒后，用无菌水冲洗3～5次，分别点在甘露醇浓度为0、50、100、150和200 mmol/L的MS培养基上，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培养箱中培养。将点播在培养基上10 d的本氏烟草和转StAN1基因的烟草幼苗移栽至甘露醇浓度为0、100、300、500、700和900 mmol/L的MS培养基上竖直培养，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培养箱中。

对播种45 d的烟草幼苗进行干旱处理，隔3 d取1次烟草叶片，冻存在-80 ℃冰箱。丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法[22]，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法[22]，超氧化物歧化酶活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[22]；基因相对表达量的测定采用2-ΔΔCT法计算。

对播种45 d的烟草幼苗同时进行干旱和热处理，将烟草幼苗置于50 ℃培养箱中，分别于0、1、3、5、7、9和11 h时取烟草叶片，用于NBT染色和基因相对表达量测定。NBT染色的方法是用0.5 mg/mL NBT没过所取样本叶片，用真空泵抽滤7～10 min，将叶片放入无水乙醇中沸水浴脱色；基因相对表达量的测定采用2-ΔΔCT法计算。

1.3 统计学分析

用Excel 2016 对数据进行统计学分析，每组均有3个以上的生物学重复。

2 结果与分析

2.1 转基因烟草鉴定

如图1，A所示，转基因烟草的叶片明显变紫。花青素含量测定结果(图1，B)显示，转基因烟草叶片中的花青素含量极显著高于野生型烟草，达到0.58 mg/g，是野生型烟草的4.83倍。

提取转基因烟草的总DNA，PCR鉴定结果(图1，C)显示，检测760 bp，与目的片段大小一致，表明StAN1基因已经成功转入，转基因烟草的阳性率是82.6%。对转基因烟草进行qRT-PCR检测，结果(图1，D)显示，转基因烟草中StAN1基因的相对表达量是本氏烟草的17倍，极显著高于本氏烟草，充分证明了StAN1基因成功在转基因植株中过表达。

A.转基因烟草图片； B.花青素含量；C.PCR鉴定转StAN1基因烟草：1.野生型烟草(WT)；2～24.转StAN1基因烟草；D.qRT-PCR鉴定转基因烟草StAN1基因表达量；WT.野生型烟草；StAN1ox. 过表达StAN1的转基因烟草；**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05);下同

2.2 干旱胁迫对转基因烟草种子萌发的影响

野生型烟草和转基因烟草种子经过10%次氯酸钠消毒后(图2，A)，点播在含不同浓度甘露醇的MS培养基上，每日观察烟草的萌发情况。鉴定烟草萌发的标准是种子露白超过种子自身长度的一半。

萌发结果(图2，B、C)显示，甘露醇浓度为0时，野生型烟草和转基因烟草的萌发情况一致，在点播5 d后萌发率均可达到96%以上。甘露醇浓度为50和100 mmol/L时，两者的萌发情况没有明显差异。甘露醇浓度为150 mmol/L时，两者的萌发率出现了明显的变化，转StAN1基因烟草在第7天时的萌发率达到了52%，是野生型烟草萌发率的2.01倍，显著高于野生型烟草萌发率。

A.烟草种子点播在培养基上第7天时萌发情况；B.0、50、100 mmol/L甘露醇浓度下的烟草种子萌发率；C. 150、200 mmol/L甘露醇浓度下的烟草种子萌发率

2.3 干旱胁迫对转基因烟草幼苗根长的影响

将萌发10 d后的烟草幼苗移栽至不同浓度甘露醇的MS培养基上竖直培养(图3)，观察根的生长情况。结果表明，野生型烟草和StAN1转基因烟草根的生长都会受到干旱胁迫的影响；在甘露醇浓度为0和100 mmol/L培养基上，转基因烟草的根长分别达到1.9和1.7 cm，分别是野生型烟草的1.46和1.30倍，比野生型烟草根长显著增加；而当甘露醇浓度上升至300、500、700和900 mmol/L时，两者之间没有显著性差异。

图3 不同浓度甘露醇下烟草根的生长情况Fig.3 Tobacco root growth under different mannitol concentrations

2.4 干旱胁迫对转基因烟草生理生化指标的影响

如图4，A所示，对野生型烟草和转基因烟草同时进行干旱处理，每隔3 d取样1次，进行生理指标测定。在未进行干旱处理时(图4，B)，两者的丙二醛(MDA)含量相当，没有显著性差异；在第3天时，干旱胁迫程度较轻，MDA含量变化差异不大；随着干旱胁迫程度的加深，野生型烟草和转基因烟草中的MDA含量均有不同程度的增加。在干旱胁迫9 d时，野生型烟草叶片中的MDA含量达到4.05 μmol/g，是转基因烟草叶片MDA含量的1.14倍，显著高于转基因烟草；在干旱胁迫12和15 d时，野生型烟草叶片中的MDA含量分别是转基因烟草的1.29和1.38倍，极显著高于转基因烟草。研究表明干旱胁迫下野生型烟草叶片中的MDA含量总体高于转基因烟草，表明野生型烟草叶片在干旱胁迫下膜脂过氧化程度相对于转基因烟草更严重，尤其在干旱胁迫后期，野生型烟草叶片受干旱影响更大。

图4 干旱胁迫下转StAN1基因烟草丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性以及脯氨酸含量变化Fig.4 Changes of malondialdehyde content,superoxide dismutase activity and proline content in StAN1 transgenic tobacco under drought stress

同时，干旱处理后测定烟草植株叶片中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，结果如图4，C所示。在没有受到干旱胁迫时，野生型烟草和转基因烟草叶片中的SOD活性没有显著性差异；在受到干旱胁迫后，野生型烟草叶片中的SOD活性有缓慢上升，而转基因烟草SOD活性出现了明显上升。在干旱处理6 d时，转基因烟草SOD活性达到了83 U/g，是野生型烟草的2.13倍；干旱处理9 d时，转基因烟草的SOD活性是野生型烟草的1.61倍，在干旱处理6～9 d内转基因烟草的SOD活性均极显著高于野生型烟草。随着干旱胁迫程度的加深，叶片水分散失，SOD活性也随之降低，不能有效消除活性氧，叶片出现了萎蔫、坏死等状况。

另外，对野生型和转基因烟草进行干旱处理后，测定烟草叶片中的脯氨酸含量，结果如图4，D所示。在刚开始受到干旱胁迫时，两者叶片中的脯氨酸含量没有显著性差异，随着干旱胁迫程度的加深，两者叶片中脯氨酸含量呈显著性差异。在干旱处理6 d时，转基因烟草叶片中的脯氨酸含量显著高于野生型烟草；干旱处理9 d时，转基因烟草的脯氨酸含量达到了野生型烟草的2.06倍；干旱处理15 d时，转基因烟草叶片中的脯氨酸含量达到117 μg/g，极显著高于野生型烟草(89 μg/g)。研究表明，在应对干旱胁迫时，转基因烟草能够很快地提高叶片中脯氨酸含量，从而增加叶片保水的能力，维持细胞渗透压，使光合作用等生命活动正常进行，保持细胞稳态。

2.5 干旱胁迫下ERF和LEA基因表达量的变化

分别在干旱胁迫1、3、5、7和9 d选取野生型烟草和转基因烟草叶片，提取总RNA并反转录成cDNA， qRT-PCR鉴定相关抗旱基因的相对表达量。如图5所示，ERF基因的相对表达量在干旱处理的第7、9、11天时，是野生型烟草的8、66和3倍，极显著高于野生型烟草的表达量；LEA基因的相对表达量在第5、7、9天时，分别达到了野生型的4、3和3倍，极显著高于野生型烟草的表达量。

图5 生长45 d的烟草幼苗干旱处理后基因相对表达量的变化 Fig.5 Relative expression of resistance gene in 45-day-old tobacco seedlings under drought treatments

2.6 旱热胁迫下NBT染色以及基因表达量的变化

对野生型烟草和转基因烟草同时进行干旱和50 ℃热处理，分别在0、1、3、5、7、9和11 h时取样，进行NBT染色和实时荧光定量PCR。结果(图6，A)显示，野生型烟草进行染色后的颜色明显比转基因烟草的叶片颜色深，说明野生型烟草在受到旱热胁迫时，叶片中有更多的过氧化物与NBT反应，产生了蓝色甲腙；而转基因烟草叶片中的活性氧含量低，产生的甲腙较少，蓝色较浅(图6，B)。

A.野生型烟草；B.转基因烟草

qRT-PCR鉴定相关抗逆基因的相对表达量结果(图7)显示，旱热处理时，LEA和ERF基因的相对表达量相对于干旱处理时都出现了显著的增加；在旱热处理的第3小时，LEA和ERF基因的相对表达量均极显著的高于野生型烟草，分别是野生型烟草的20.9和2.25倍。

图7 生长45 d的烟草幼苗旱热处理后基因相对表达量的变化Fig.7 Relative expression of resistance gene in 45-day-old tobacco seedlings under drought heat treatments

3 讨 论

生物体内的花青素合成主要受到结构基因和转录因子的调节。结构基因主要控制合成苯丙素途径中的一些关键酶，苯丙素经过PAL、CHS、CHI、F3H和DFR等酶的催化反应，最终合成花青素；此外，MYB、bHLH和WD40这3类转录因子在花青素合成的过程中也起着关键作用，可以形成MBW蛋白复合体调控基因的表达[23]，进一步调控花青素的合成。StAN1转录因子是MYB转录因子中的一个，能够有效促进花青素的合成与积累。当植物响应生物或非生物胁迫时，花青素是一种有效的保护物质，以减轻植物所受到的伤害。在自然条件下，花青素多与糖苷结合以花色苷的形式存在，常见的有天竺葵素、矢车菊素和花翠素等[23]。

在受到干旱胁迫之后，转基因烟草由于花青素含量高，其较强的活性氧清除能力是由花青素化学结构中的羟基和酰基等这些化学基团决定[24]，从而保护植物组织以及生命活动正常进行，使得植物具有一定的耐旱性。野生型烟草花青素含量较低，不能及时清除多余的活性氧，植株受到的损伤严重。

LEA蛋白的表达量与植物耐受非生物胁迫有着密切的调控关系，LEA的启动子序列除了含有核心的启动子元件外，还有顺式元件MYB的结合位点[24-25]，同时也有研究表明MYB类转录因子在植物应对非生物胁迫时能够响应更大范围的下游调控[26]。因此，转基因烟草中，StAN1基因的表达，可能会上调表达MYB家族的基因，从而结合在LEA基因的启动子序列，上调表达LEA蛋白，增强转基因烟草的耐热耐旱性。ERF类转录因子参与植物种子萌发以及非生物胁迫的调控[27]，还广泛参与植物的次生代谢。干旱可以诱导小麦中ERF基因的转录[28]，转ERF基因的拟南芥以及烟草对非生物胁迫的耐受性有所提高，植物自身次生代谢产物的积累也能够有效地调控植物应对生物或者非生物胁迫。已有研究表明，ERF能够有效地促进木质素的积累，而木质素的上游合成途径是从苯丙素合成途径开始，这也是花青素合成的上游途径之一，因此，ERF调控木质素合成的同时，也可能间接提高花青素的合成，从而提高植物耐热耐旱性。而且，也有研究表明，ERF会与一些MYB家族的转录因子结合，形成转录因子复合物调控次级代谢产物的合成[29]。

综上所述，本试验通过干旱处理不同时期的转基因烟草，并且测定丙二醛和脯氨酸等生理指标，发现StAN1在提高转基因烟草花青素含量的同时，在植物应对干旱和热胁迫时也有一定的作用。干旱和旱热处理时，转基因烟草中LEA和ERF基因的表达均显著高于野生型烟草，一定程度上提高了转基因烟草的耐热耐旱性。本研究结果为进一步深入研究StAN1基因功能奠定了坚实的基础。