和田沙漠玫瑰品种系统发育关系初步研究

孙美乐，张 俊，李 岩，蔺国仓*

(1 新疆农业科学院 综合试验场，乌鲁木齐 830012；2 新疆大学 资源与环境科学学院，乌鲁木齐 830046)

杂交和多倍化是植物进化的两个重要过程[1]。蔷薇属物种间杂交障碍很低[2]，种间杂交、基因渐渗以及多倍化极大丰富了蔷薇属的物种多样性[2-5]，超过一半的物种为多倍体。然而，杂交和多倍化导致蔷薇属物种种间表型特征趋同化，给物种鉴定带来了困难[6]。

玫瑰(Rosarugosa)原产于亚洲东部地区，在中国东部沿海、日本、朝鲜和俄罗斯远东地区均有分布。玫瑰能与蔷薇属其他物种进行天然和人工杂交，产生杂交渐渗后代和杂交品种。于18世纪引入欧洲，与欧洲、地中海、中东地区的十余种蔷薇属(Rosa)植物，如月季花(R.chinensis)、大花香水月季(R.odoratavar.gigantea=R.gigantea)、麝香蔷薇(R.moschata)、露西亚蔷薇(R.luciae)、野蔷薇(R.multiflora)、法国蔷薇(R.gallica)、重瓣异味蔷薇(R.foetida)，发生广泛杂交产生了目前世界上常见的蔷薇属园艺品种，通常被称作现代玫瑰或月季品种[7]，如‘法兰西(La France)’是中国蔷薇与欧洲蔷薇的杂交品种[8]；紫枝玫瑰(R.rugosa‘ZiZhi’)为平阴玫瑰与山刺玫(R.davurica)的杂交种。

玫瑰是中国的传统名花及油用植物之一，在长达两千多年的玫瑰栽培历史中，出现了许多特色栽培品种，如紫枝玫瑰、丰花玫瑰(R.rugosa‘Fenghua’)、和田沙漠玫瑰(R.rugosa‘Hetianshamomeigui’)。新疆和田是国内四大玫瑰产区(山东、甘肃、云南、新疆)之一，地处中国极端干旱区、塔克拉玛干沙漠南缘，自然地理环境和水土光热条件独特，非常适宜玫瑰生长发育，该地区已有两千多年的玫瑰栽培历史。和田沙漠玫瑰以其品质好、丰产性好、抗逆性强，树体耐盐碱、耐旱、抗病虫害特点突出，得到了大力推广种植，并形成了成熟的种植加工产业链。截至2019年，和田沙漠玫瑰栽培面积已达4667 hm2，产量2.8万t。对于南疆贫困地区增加地方税收和群众收入，打赢脱贫攻坚战具有重要的促进作用。虽然和田沙漠玫瑰在和田地区有着悠久的食用历史，但不能证明其属于重瓣红玫瑰(R.rugosavar.plena，平阴玫瑰)，无法作为普通食品进行生产经营，造成北京、上海、广州等城市产品下架退货，从而严重制约了和田地区玫瑰加工产业的发展。因此，明确和田沙漠玫瑰与重瓣红玫瑰品种之间的关系，对于将和田沙漠玫瑰作为普通食品推向市场，促进新疆的玫瑰产业向优质高效、标准化、规范化方向发展具有重要的作用。基于此，本研究利用单拷贝核GAPDH基因和叶绿体(cp)DNAtrnL-F、trnH-psbA序列分析和田沙漠玫瑰与重瓣红玫瑰品种(丰花玫瑰、紫枝玫瑰)之间的遗传距离和相似度，确定它们之间的关系以及是否为同一品种，分析和田沙漠玫瑰在蔷薇属内的系统发育关系，探讨和田沙漠玫瑰的起源。

1 材料和方法

1.1 材 料

研究材料为和田沙漠玫瑰(Hetian)、丰花玫瑰(Fenghua)、紫枝玫瑰(Zizhi)和大马士革玫瑰(突厥蔷薇R.damascena，Damask)。和田沙漠玫瑰为直立丛生小灌木，高约2 m；小枝密被针刺、腺毛及淡黄色的皮刺，小叶 5～9；叶片椭圆形或椭圆状倒卵形，边缘有尖锐锯齿，上面深绿色，无毛，叶脉下陷，下面灰绿色，密被绒毛和腺毛，中脉有稀疏硬刺；托叶大部贴生于叶柄；花数朵簇生，花梗密被腺毛，花直径 4～6.5 cm，重瓣至半重瓣，芳香，紫红色(图1)，花柱离生，被毛，稍伸出萼筒外，比雄蕊短很多。花梗长约3 cm，表面有稀疏刚毛；果实瓶状，长约2 cm，直径1～1.2 cm，果皮成熟时金黄色，阳面有红晕，表面有稀疏刚毛，萼片脱落。花期5～6月。大马士革玫瑰是一种主要的油用玫瑰品种，起源于中东(伊朗)一带，现广泛分布在地中海沿岸的一些国家和地区，在保加利亚、土耳其、法国等都有栽培，中国也有不少地方引种大马士革品种。和田沙漠玫瑰精油成分与大马士革玫瑰精油成分组成较相似。丰花玫瑰和紫枝玫瑰为重瓣红玫瑰中产量高、品质好、适应性强的2个品种，种源为传统重瓣红玫瑰，均收录于中国食药名录中。

图1 4个玫瑰品种的形态特征Fig.1 The morphological feature of the four rose varieties

本研究所用和田沙漠玫瑰采自和田地区于田县、墨玉县，随机采集10个植株；丰花玫瑰、紫枝玫瑰和大马士革玫瑰由山东平阴玫瑰研究所提供。每个品种随机选择5个个体，从每个植株上采集幼嫩叶片5～10片，硅胶干燥。以上25份叶片样本用于DNA测序分析。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA提取取干燥后的叶片0.05 g，液氮研磨后，利用CTAB法[9]提取叶片基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检查基因组DNA的质量，利用微量核酸分析仪(Nanodrop)检测DNA浓度。

1.2.2 基因扩增和测序利用已发表引物扩增基因片段核GAPDH基因[3]、cpDNApsbA-trnH[10]和trnL-F[11]片段。反应体系25 μL，含DNA 50～100 ng，引物浓度0.1～0.2 μmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，1.5 mmol/L MgCl2， 0.5 U Taq DNA聚合酶。

反应程序：GAPDH：94 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35循环，最后72 ℃延伸10 min。

psbA-trnH：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35循环，最后72 ℃延伸10 min。

trnL-F：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，35循环，最后72 ℃延伸10 min。

扩增产物经电泳检测和纯化后，送至上海生工进行测序。挑选和田沙漠玫瑰6个个体，丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰各2个个体进行GAPDH测序；GAPDH利用克隆测序方法完成测序，将GAPDH扩增产物连接到克隆载体上，每个个体挑选10个阳性克隆进行双向测序。所有25个个体均进行psbA-trnH和trnL-F序列测序，利用扩增引物进行双向测序。

1.2.3 序列整理和分析对测序原始数据进行整理，剔除测序质量低的碱基，双向序列利用Sequencer V4.4组装，组装后的序列利用ClustalW进行比对。对照原始峰图文件检查变异位点，对序列进行校正。

对GAPDH基因，同一个品种的所有克隆序列，逐一对多态性核苷酸位点进行核实，当两个及两个以上单克隆某位点的单核苷酸变异相同时，该变异位点视为有效。如果两个及两个以上单克隆序列一致时，这些序列被视为一条序列用于后续分析。cpDNApsbA-trnH和trnL-F均获得较理想的测序结果，将2个片段串联合并后用于后续分析。

利用核GAPDH克隆基因序列计算和田沙漠玫瑰与其他3个品种玫瑰间的遗传距离和遗传相似度，遗传距离计算由软件MEGA 7.0完成。从基因数据库中下载蔷薇属其他物种的GAPDH、psbA-trnH和trnL-F基因片段的数据(表1)，分别对核GAPDH和cpDNA进行系统发育分析，构建最大简约(MP)系统发育树和贝叶斯系统发育树。最大简约法参数设置：最大简约搜索方法TBR，gaps/missing位点数据部分删除，利用自展法(1000次)评估系统发育树的支持率。利用MEGA 7.0软件进行MP系统发育分析，并基于BIC标准筛选最优碱基替代模型。利用Beast V1.7软件包进行贝叶斯系统发育分析，参数设置：碱基替代模型为HKY+G，GAPDH和cpDNA MCMC分别运行800万次和500万次，每运算1 000次取1次样。GAPDH和cpDNA数据各独立运算2次，运算完成后，利用Tracer V1.5检测有效样本量(每个参数的ESS值均大于200)，之后利用LogCombiner V1.7将2次运算的结果合并。舍弃10%老化树(burnin)，利用剩余的90%树构建最大可信树，用后验概率(PP)值检验分支可信度。

表1 本研究所用蔷薇属和外类群物种以及DNA序列的GenBank序列号

2 结果与分析

2.1 测序数据

测序共获得和田沙漠玫瑰6个体(59个克隆)、丰花玫瑰2个体(19个克隆)、紫枝玫瑰2个体(19个克隆)以及大马士革玫瑰2个体(19个克隆)，共118个GAPDH克隆序列；和田沙漠玫瑰6个体的59个GAPDH克隆序列长739 bp，其中变异位点有66个，简约信息位点有28个，平均遗传距离为0.017。和田沙漠玫瑰10个个体的叶绿体DNA(cpDNA，psbA-trnH+trnL-F)序列完全一致，总长度1 341 bp。紫枝玫瑰、丰花玫瑰和大马士革玫瑰的cpDNA序列也完全一致，总长度分别为1 390 bp、1 390 bp和1 444 bp，4个品种的cpDNA检测到24个多态位点和简约信息位点。

续表1 Continued Table 1

2.2 遗传距离分析

基于GAPDH序列，和田沙漠玫瑰品种内的遗传距离为(0.017±0.003)，紫枝玫瑰、丰花玫瑰、大马士革品种内的遗传距离分别为(0.009±0.002)、(0.011±0.002)、(0.015±0.003)；和田沙漠玫瑰与丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰的品种间遗传距离分别为(0.029±0.005)、(0.024±0.004)、(0.022±0.003)，均大于品种内遗传距离。和田沙漠玫瑰与其他3个玫瑰品种间的遗传相似性分别为0.971、0.976、0.978(表2)。cpDNA数据表明4个品种内的遗传距离为0；和田沙漠玫瑰与丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰的品种间遗传距离分别为(0.014±0.005)、(0.014±0.004)、(0.008±0.003)。和田沙漠玫瑰品种内的遗传距离均小于与其他品种间的遗传距离。

表2 基于核GAPDH的和田沙漠玫瑰与3个玫瑰品种之间的遗传参数

基于4个品种118个GAPDH克隆序列构建的系统发育树(图2)表明，大马士革玫瑰19个克隆聚为两个分支，紫枝玫瑰、丰花玫瑰的部分克隆序列分别聚为独立分支(Zizhi、Fenghua)，它们两个的部分序列聚在一起(Zizhi & Fenghua分支)。和田沙漠玫瑰的59个克隆序列聚为3个支持率较高的分支，与其他3个玫瑰的克隆序列没有混合聚类现象，表明和田沙漠玫瑰与其他3个玫瑰品种之间没有共享克隆序列。

Hetian. 和田沙漠玫瑰；Zizhi. 紫枝玫瑰；Fenghua. 丰花玫瑰；Damask. 大马士革玫瑰；分支上的数字为自展值(BP)/后验概率(PP)值；数字+字母组合(如2A)代表一条GAPDH克隆，其中数字代表个体编号，字母代表该个体的GAPDH克隆编号，下同

2.3 系统发育分析

基于GAPDH序列的蔷薇属系统发育树(图3)显示和田沙漠玫瑰的序列聚到3个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)中，分支Ⅰ包括了和田沙漠玫瑰克隆和硕苞蔷薇(Rosabracteata，硕苞组sect.Bracteatae)、金樱子(R.laevigata，金樱子组sect.Laevigatae)、小果蔷薇(R.cymosa，木香组sect.Banksiae)和木香花(R.banksiae，木香组)4个物种；分支Ⅲ由7个和田沙漠玫瑰克隆和椭叶蔷薇(R.elliptica，sect.Caninae)、R.trachyphylla(sect.Caninae)、常绿蔷薇(R.sempervirens，合柱组sect.Synstylae)和R.abyssinica(合柱组)4个物种聚成；分支Ⅱ由3个和田沙漠玫瑰克隆聚成，表明和田沙漠玫瑰与8个物种具有较近的亲缘关系。丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰的克隆分别聚在5个分支(Ⅳ～Ⅷ)内。和田沙漠玫瑰与其他3个玫瑰品种之间无共享克隆序列。另外和田沙漠玫瑰的部分克隆位于系统发育树的基部，说明和田沙漠玫瑰的遗传组成比较古老。

分支上的数字为自展值(BP)/后验概率(PP)值；--表示BP值低于50%或者PP低于0.5。下同

叶绿体DNA系统发育显示，和田沙漠玫瑰与14个蔷薇属物种聚到分支Ⅰ中(图4)，分别为Caninae组8个物种：犬蔷薇(R.canina=R.vosagiaca)、凯西亚蔷薇(Rosacaesia)、平叶蔷薇(R.obtusifolia)、山地蔷薇(R.montana)、亚卡蔷薇(R.subcanina)、苏氏蔷薇(R.subcollina)和东方蔷薇(R.orientalis)，法国蔷薇组(sect.Gallicanae)3个物种：法国蔷薇(R.gallica)、白蔷薇(R.alba)和百叶蔷薇(R.centifolia)，以及合柱组(sect.Synstylae)3个物种：莱舍鲁蔷薇(R.leschenaultiana)、腓尼基玫瑰(R.phoenicia)和常绿蔷薇(R.sempervirens)。大马士革玫瑰聚为分支Ⅱ；丰花玫瑰、紫枝玫瑰与玫瑰聚为分支Ⅲ，丰花玫瑰、紫枝玫瑰个体混合聚集，说明两者亲缘关系很近。和田沙漠玫瑰与其他3个玫瑰品种的个体没有混合现象，表明它们之间的亲缘关系较远。

图4 基于叶绿体DNA构建的蔷薇属系统发育树Fig.4 The phylogeny of genus Rosa constructed with cpDNA

2.4 序列变异分析

和田沙漠玫瑰与近缘物种的GAPDH基因序列比对检测到87个变异位点，和田沙漠玫瑰有19个杂合位点(表3)，其中若干种可能参与了和田沙漠玫瑰的形成，为其提供遗传信息。对GAPDH和cpDNA系统发育分析获得的与和田沙漠玫瑰具有较近亲缘关系的17个物种进行叶绿体序列比对分析，发现凯西亚蔷薇、莱舍鲁蔷薇、白蔷薇、平叶蔷薇、山地蔷薇、亚卡蔷薇与和田沙漠玫瑰的叶绿体序列完全一致；法国蔷薇、百叶蔷薇与和田沙漠玫瑰的叶绿体序列有1个碱基的差异；东方蔷薇与和田沙漠玫瑰的叶绿体序列有2个碱基的差异，而犬蔷薇、腓尼基玫瑰、常绿蔷薇等物种与和田沙漠玫瑰序列差异较大(图5)。

表3 和田沙漠玫瑰GAPDH基因的杂合位点

图5 和田沙漠玫瑰品种与近缘蔷薇属物种的叶绿体DNA序列变异分析Fig.5 Sequence variation analysis of cpDNA for R. rugosa ‘Hetian shamomeigui’ and closely related Rosa species

3 讨 论

和田地区自然地理环境和水土光热条件独特，气候干旱、降水少蒸发高、昼夜温差大，经过两千多年的栽培实践，培育了和田沙漠玫瑰品质好、丰产性好、抗逆性抗病虫害的特点，在当地得到了大面积种植，并形成了成熟的种植加工产业链。然而一直以来，和田沙漠玫瑰与重瓣红玫瑰之间的关系未进行明确研究，导致和田沙漠玫瑰无法作为普通食品进行生产经营，严重制约了和田地区玫瑰加工产业的发展。本研究表明，和田沙漠玫瑰品种内遗传距离低于与丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰3个品种间的遗传距离，与它们的遗传相似性分别为0.971、0.976和0.978。系统发育分析表明和田沙漠玫瑰与其他3个玫瑰品种的无混合聚类关系，说明和田沙漠玫瑰与其他重瓣红玫瑰(紫枝玫瑰、丰花玫瑰)不是同一品种，而是一个独立的品种。

蔷薇属包含150～200个物种。Wissemann[12]根据蔷薇物种表型特征将该属划分为4个亚属——蔷薇亚属(Rosa)、单叶蔷薇亚属(Hulthemia)、Platyrhodon亚属以及Hesperhodos亚属。诸多学者开展了蔷薇属的分子系统学研究[6,13-16]，然而研究结果并不一致。传统划分的大部分亚属、组均不是单系群[6]，这可能与蔷薇属较低的遗传分化有关[13,15]以及属内较弱的种间杂交障碍和频繁的杂交有关[3-5]，杂交令属内物种间的系统发育关系复杂化甚至混乱[13]，如基于核基因、叶绿体基因的系统发育关系不一致[15]。

本研究发现，基于核GAPDH和cpDNA获得的系统发育树的拓扑结构不一致，这可能与所用的物种不一致有关，部分物种或者只有核DNA数据或者叶绿体数据。和田沙漠玫瑰的GAPDH克隆序列聚在三个分支内，其中一个分支与来自中国或东南亚的硕苞组(sect.Bracteatae)、金樱子组(sect.Laevigatae)、木香组(sect.Banksiae)物种聚在一起，且位于系统发育树的基部位置，木香组2个物种(木香花、小果蔷薇)和金樱子组1个物种为中国特有种；硕苞组1～2种分布于东南亚；另一个分支与来自欧洲的Caninae组、合柱组(sect.Synstylae)、法国蔷薇组(sect.Gallicanae)物种聚在一起；第三个分支包含较少的克隆，单独聚为一个分支。叶绿体DNA的系统发育分析揭示的物种聚类情况与Fougère-Danezan等的研究[6]具有较高一致性，和田沙漠玫瑰与欧洲的14个蔷薇属物种亲缘关系很近，这14个物种属于Caninae组、法国蔷薇组和合柱组。此外，序列变异分析发现和田沙漠玫瑰GAPDH的多个位点为杂合位点，和田沙漠玫瑰与部分欧洲物种叶绿体DNA序列一致或1～2个碱基的差异，与硕苞组、金樱子组、木香组的3个物种存在9～11个碱基的差异。这些研究结果表明和田沙漠玫瑰与中国和欧洲的蔷薇属物种具有很近的亲缘关系，其遗传组成较为独特，含有中国和欧洲物种的基因组分，暗示和田沙漠玫瑰的杂交起源。研究表明Caninae组的所有物种都可能是多倍体[6]，并且Caninae组、法国蔷薇组、合柱组及其他组的一些物种为杂交物种(如百叶蔷薇、白蔷薇)，甚至作为杂交亲本参与了蔷薇属物种或玫瑰品种的形成[8]。

现代玫瑰品种为杂交而来，8～20个物种参与了现代玫瑰杂交品种的形成[17-18]，如重瓣异味蔷薇、野蔷薇、月季花、紫月季花(R.chinensisvar.semperflorens)、香水月季(R.odorata)、大花香水月季、光叶蔷薇(R.wichuraiana=R.luciae)、华西蔷薇(R.moyesii)、硕苞蔷薇(R.bracteata)、法国蔷薇、麝香蔷薇。DNA序列或者分子标记的研究有利于揭示蔷薇属物种或栽培品种的杂交起源。Iwata等[14]基于核ITS序列和叶绿体psbA-trnH序列研究发现麝香蔷薇、法国蔷薇、腺果蔷薇(R.fedtschenkoana)3个物种是古大马士革玫瑰变种(oldest Damask varieties)的原始杂交亲本；Meng等[19]研究证明3个茶香月季(tea-scented China roses)品种香水月季(R.odoratavar.odorata)、橘黄香水月季(R.odoratavar.pseudindica)和粉红香水月季(R.odoratavar.erubescens)由大花香水月季和月季花杂交而来。王开锦等[20]研究了十倍体中甸刺玫的系统位置及杂交起源，指出细梗蔷薇、华西蔷薇、尾萼蔷薇、西南蔷薇和西北蔷薇是中甸刺玫的近缘野生种，其原始母本最可能是尾萼蔷薇、西南蔷薇和西北蔷薇的其中之一或共同母本，细梗蔷薇和华西蔷薇极可能是其父本，而尾萼蔷薇、西南蔷薇和西北蔷薇也可能以父本的身份参与了中甸刺玫的杂交物种形成。本研究发现，和田沙漠玫瑰其遗传组成较为独特，含有中国和欧洲物种的基因组分，这暗示和田沙漠玫瑰为杂交起源，并且其亲本可能为中国物种和欧洲物种杂交而来，杂交亲本可能为Caninae组、合柱组、法国蔷薇组，硕苞组、金樱子组、木香组，结合其叶绿体序列与欧洲物种序列一致，其母本可能是来自欧洲的Caninae组、合柱组、法国蔷薇组的物种。和田沙漠玫瑰外形上与百叶蔷薇相似，而百叶蔷薇是法国蔷薇、腓尼基玫瑰、麝香蔷薇、犬蔷薇的杂交后代(大马士革玫瑰)与白蔷薇杂交而来[21]。然而，现阶段和田沙漠玫瑰杂交亲本的推断是基于目前基因数据库已发表物种分析而得到的，结果具有一定局限性，例如，部分物种序列不全，有的物种有叶绿体序列而没有核GAPDH序列，给准确判定和田沙漠玫瑰亲本物种来源的带来一定困难。后续需要对上述可能的亲本物种展开采样和研究，并通过生理生化性状以及基因组SNP分析，明确和田沙漠玫瑰的杂交亲本来源。

本研究基于分子数据揭示了和田沙漠玫瑰品种与重瓣红玫瑰、大马士革玫瑰品种的关系，探讨了和田沙漠玫瑰的系统发育关系及其杂交起源，为进一步揭示和田沙漠玫瑰的起源和亲本提供了基础。和田沙漠玫瑰具有独特的遗传组成，品种内遗传距离小于与其他3个品种的遗传距离，在系统发育上，没有与其他3个品种的序列发生聚集，因此，其遗传上区别于丰花玫瑰、紫枝玫瑰、大马士革玫瑰，应视为独立的品种。系统发育和序列变异分析显示和田沙漠玫瑰与来自中国或东南亚的硕苞组、金樱子组、木香组，以及与欧洲Caninae组、合柱组、法国蔷薇组物种聚在一起，表明和田沙漠玫瑰的杂交起源，并且可能为中国和欧洲蔷薇属物种或品种杂交而来，杂交亲本可能为硕苞组、金樱子组、木香组、Caninae组、合柱组、法国蔷薇组的若干物种。