中医药防治肝癌复发转移的研究进展*

姚依勍，龚亚斌

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

原发性肝癌(特指肝细胞癌，以下简称肝癌)是消化系统常见的恶性肿瘤，通常伴随多种相关基因的异常表达[1]。据统计[2]，每年约有100多万人被诊断为肝癌。中国作为肝癌发病率最高的国家之一，每年新发病例约占全世界的50%；在60岁以下的男性中，中国肝癌的发病率和死亡率位居世界第一[3]。中医对癌瘤侵袭转移的认识最早见于《黄帝内经》中“传舍”这一概念[4]，现代中医则认为癌病的基本病机是本虚标实，而其转移的关键原因在于“正气不足”。对于肝癌的病因病机，有学者提出气滞、痰凝、血瘀是其主要病因[5]，其中血瘀与侵袭转移关系最为密切。在我国的肝癌防治工作中，中医药发挥了重要而独特的作用，同时也开展了广泛的临床与机制研究。Chen[6]等通过纳入7项已发表的随机对照试验(RCT)进行Meta分析，结果显示，肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization, TACE)联合中医治疗方案在晚期肝癌治疗方面显示出最高疗效；其次是索拉非尼联合肝动脉灌注化疗。由此可知，中医药预防和治疗肝癌复发转移的作用机制应越来越受到临床与学术界的重视。

1 直接细胞毒作用

细胞增殖是肝癌侵袭与转移的关键步骤，某些中药可通过影响癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、直接杀伤癌细胞等直接细胞毒作用减少癌细胞侵袭和转移。自噬作为一种溶酶体降解途径，肝细胞中缺乏自噬与促进肝损伤和肿瘤发生有关，mTOR信号通路在自噬受损的肝脏肿瘤发病机制中起关键作用[7]。作为中药中提取的天然成分，生物碱(alkaloid)按照种类可分为哌啶生物碱、异喹啉生物碱、吲哚生物碱、萜类生物碱、甾体生物碱和其他生物碱，被证实具有显著的抗肝癌作用，作用机制包括抑制细胞增殖、转移和血管生成、改变细胞形态、促进细胞凋亡和自噬、触发细胞周期阻滞、调节多种癌症相关基因和途径等[8]。Han[9]等从败酱提取物中鉴定出主要由黄酮类化合物、黄酮醇和酚酸组成的14种化学成分，对肝癌细胞具有很好的抑制作用。Wang[10]等发现，补骨脂素能激活内质网应激信号途径，增加葡萄糖调节蛋白78、DNA损伤诱导转录因子3、活性转录因子4、X-盒结合蛋白1、谷氨酸脱羧酶34、肌醇依赖性激酶1α、生长分化因子-15的蛋白水平，通过增强细胞周期蛋白D1和降低细胞周期蛋白E1的表达诱导细胞周期阻滞于G1期，从而抑制肝癌SMMC7721细胞株的增殖，促进细胞凋亡。Tian[11]等发现，女贞子乙醇提取物可通过调节B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)和细胞色素C的表达及caspase-3的活性促进细胞周期阻滞，从而促进肝癌Bel-7402和Huh-7细胞的凋亡。甘草是中医治疗肝病和药物性肝损伤最常用的中草药之一，从甘草中分离和鉴定出各种生物活性成分包括甘草甜素、甘草次酸、甘草素、异甘草素、甘草酮A和甘草香豆素[12]。Wang[13]等研究发现，甘草酸和阿霉素联合治疗可通过调节Bax/Bcl-2比值和caspase-3活性的凋亡途径，实现对HepG2肝癌细胞和H22荷瘤小鼠的靶向抗癌作用。中药还可抑制癌细胞DNA的修复。Kuo[14]等发现，有机硫化合物二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可增加酵母细胞对DNA损伤的敏感性，提高以DNA损伤为主的癌细胞药物敏感性。Gao[15]等研究发现，中成药护肝片可通过增加LC3II和beclin1水平触发细胞自噬，并通过下调细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2, CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)和细胞周期蛋白E1的表达将细胞周期阻滞在G0-G1期发挥抗肿瘤作用。Wang[16]等采用阿魏素处理Huh7肝癌细胞可明显抑制G0/G1期细胞的产生，减少S期细胞在细胞周期中的积聚，诱导细胞凋亡，其机制与NF-κB(P65)、COX-2和pPAR-γ活性的调节密切相关。

2 抑制肝癌细胞的黏附侵袭能力

在侵袭和转移过程中，肝癌细胞需要与周围细胞黏附分离侵袭细胞外基质，或使血行肝癌细胞黏附于血管内皮细胞进行转移；细胞黏附分子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)在此过程中起主要调节作用。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞源性恶性细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，可使上皮细胞失去细胞极性，失去与基底膜的连接，其主要的分子标记有E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、转录因子Snail、Twist等。microRNAs(MiRNAs)是一种小型非编码RNA，在转录后调节基因表达，负责调节超过70%的人类基因。Sun[17]等查阅文献发现，miR-708在肺癌、膀胱癌和大肠癌细胞系中的表达水平较高，而在肝细胞癌、前列腺癌和胃癌等细胞系中的表达水平较低。Ye[18]等提出，miR-373在肝癌组织中的转录水平与癌旁正常组织相比显著下调，并与肝癌患者的临床预后相关。Zhang[19]等研究发现，MiR-199表达的增加可以通过抑制Snail的表达抑制肝癌细胞的EMT过程和侵袭能力。长非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNAs)被证实，与包括HCC在内的多种癌症有关。He[20]等研究发现，lncRNA FAM83 A-AS1在肝癌组织和细胞中的表达水平显著增加，且FAM83 A-AS1可通过与NOP58结合来增强FAM83 A的稳定性，从而促进肝癌的进展。从龙血竭中分离出的双黄酮类His-4诱导人肝癌HepG2和SK-Hep-1细胞凋亡，抑制HepG2和SK-Hep-1细胞的迁移和侵袭，其机制与MAPK信号通路的上调和mTOR信号通路的下调有关[21]。Cheng[22]等提出，苍术可通过线粒体凋亡途径诱导肝癌细胞凋亡，并通过抑制EMT过程和下调MMP-2和MMP-9的表达以抑制肝癌细胞的迁移与侵袭。

3 调控肝癌转移的相关信号通路

除上述mTOR、MMP和EMT等关键路径外，调控肝癌侵袭转移的主要信号通路还包括：一是Ras/Raf/MAPK信号通路。Ras基因被激活时可分别通过Ras/Raf通路和Rho/Rac通路介导MAPK信号通路，通过调控细胞基质、细胞运动以及肿瘤微血管等多方面因素干预肝癌的侵袭转移过程；二是Wnt/β-catenin信号通路。通过调控细胞的黏附、细胞基质降解以及微血管新生等因素，在肝癌的侵袭转移过程中起着重要作用；三是核因子-κB信号通路。可通过抑制NF-κB信号通路调控相应的基因和蛋白，抑制肝癌细胞的转移；四是PTEN/PI3K/Akt通路。作为一种抑癌基因PTEN可作用于PI3K下游靶分子PIP3，在抑制肝癌细胞转移和抑制肿瘤血管生成方而起重要作用；五是JAK/STAT信号通路。通过调控MMPs、EMT的表达以及微血管生成等来抑制肝癌细胞的侵袭转移；六是肿瘤缺氧微环境相关信号通路。肿瘤的生长、浸润和转移还依赖新生血管形成，与之相关的信号通路包括血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)和肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor, HGFR)等，其中表皮生长因子受体激酶底物8(epidermal growth factor receptor kinase substrate 8, Eps8)在多种实体肿瘤中起关键作用。研究表明[23]，EPS8L3在肝癌组织和肝癌细胞系中表达显著上调，与肝癌分级和死亡率密切相关。整合素α7(Integrin α 7, ITGA7)在肝癌SMMC-7721、Hep G2、HUH-7和BEL-7404细胞系中上调，并通过PTK2-PI3K-Akt信号通路调节细胞增殖、凋亡和CSCs标志物，与肝癌患者的临床预后呈负相关[24]。

Wu[25]等通过体外和体内药理实验发现，补肾健脾汤可延长肝癌患者的生存时间，诱导肝癌细胞凋亡，其机制与PI3K、Akt、P53、CASP3和Bcl-xl/Bad的表达调节有关。Pan[26]等研究发现，Fucoidan-马尾藻多糖可抑制肝癌SMMC-7721、Huh7和HCCLM3细胞的迁移与侵袭并呈剂量依赖性；在HCCLM3细胞中，Fucoidan-马尾藻多糖可降低包括Src、Cortactin、N-Wasp、Arp3、Cdc42、MMP2、mt1-MMP3和靶向受体整合素αV及β3在内的Indododia相关蛋白的表达水平。肝纤维化是多数慢性肝病最常见的病理特征，持续恶化可逐渐发展为肝硬化并最终导致肝癌。中药中能有效抗肝纤维化的成分主要包括黄酮类、皂苷类、多糖类和生物碱类，其作用机制包括抑制肝脏炎症、抗脂质过氧化损伤，抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化与增殖，调节促纤维化因子合成和分泌及细胞外基质(ECM)的合成与降解[27]。Wu[28]等发现，中药郁金散可阻断MAPK和PI3K/Akt信号通路，对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有抗纤维化作用；此外，汉黄芩素也能促进转化生长因子-β1激活的大鼠肝星状细胞T6细胞和人LX-2细胞的凋亡，提高T6细胞中cle-caspase3、cle-caspase9的表达和Bax/Bcl-2的比值，治疗和预防肝纤维化[29]。Xiao[30]等研究发现，喜树碱(camptothecin，CPT)处理可导致HepG2和HCT116肝癌细胞S期与G2/M期阻滞，并通过激活内源性和外源性途径及诱导ROS积聚，减少MMP改变2种细胞凋亡途径中相关基因与蛋白的表达，以促进细胞凋亡。作为一种从常用中草药苦参中提取的天然化合物，毒剂量的苦参碱可显著抑制PLC/PRF/5和MHCC97 L肝癌细胞的迁移与侵袭，其机理与结合MMP-9残基的结合亲和力有关[31]。同样，从山松(Pseudolarix Kaempferi)根皮中分离出的二萜酸假松脂酸B(pseudolaric acid b，PAB)，可通过抑制Stat3、ERK1/2、Akt和GSK-3β/β-catenin等致癌信号通路发挥抗癌活性[32]。

4 其他作用机制

4.1 减毒增效

肝癌的主要治疗方法包括介入治疗、放疗和化疗，一些中药抗癌药物与其具有一定的协同减毒作用，能够提高患者的免疫力，延长患者的长期生存率，减少治疗的副作用。Ding[33]等通过体外试验研究发现，多西紫杉醇(DTX)和胡椒碱(PIP)共同给药可以发挥协同效应，与单用DTX相比可增加细胞毒性并改善HepG2肝癌细胞的抗癌活性。3，3‘-二吲哚甲烷(DIM)来源于十字花科蔬菜芸苔属植物中的吲哚-3-甲醇(I3C)，Jiang[34]等研究发现，DIM可抑制SMMC-7721和HepG2肝癌细胞增殖，其关键步骤继发于p38MAPK的[Ca2+]i依赖性激活，说明钙离子载体可增强DIM诱导的抗癌作用，二者联合治疗可提高肝癌的化疗效果。Ding[35]等通过动物实验研究发现，白首乌提取物可有效减轻二乙基亚硝胺(DEN)诱导的TLR4过度表达产生的肝损伤，使肝炎、肝硬化和肝癌中常见的MyD88、TRAF6、NF-κB p65、转化生长因子-β1和α-sma表达水平显著下调。

4.2 抗耐药作用

肝外门静脉阻塞(EHPVO)常发生于转移性癌症患者，可导致肝酶升高，阻断肝癌患者的化疗进程[36]；缺氧是包括肝细胞癌在内的许多实体肿瘤的共同特征，可通过激活Sonic Hedgehog(Shh)途径和缺氧诱导因子-lα(hypoxia inducible factor-lα, HIF-lα)的发生，并与EHPVO共同作用。柴胡皂甙-d(SSD)是柴胡的主要生物活性成分之一，具有多种生物学作用。Zhang[37]等发现，SSD可以逆转缺氧促进的效应，尤其可通过抑制活性哨蛋白/小泛素样修饰物(SUMO)特异性蛋白酶5(SENP5)、SUMO1和GLI蛋白的表达来抑制肝癌细胞的恶性表型，同时增加其在体外和体内缺氧下对单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV)药物系统的敏感性。Zang[38]等研究发现，黄芪和温郁金可通过增加人脐静脉内皮细胞和内皮瘤细胞标记物CD34的表达减少HIF1α的表达，以促进肝癌血管内皮细胞的血管正常化，降低化疗药物的耐药发生率。

4.3 改善相关症状

健康相关生活质量(health-related quality of life, HRQoL)是肝癌患者总体生存的重要预后因素，与临床分期和肝功能无关[39]。癌性发热是晚期恶性肿瘤的常见症状之一，严重影响患者的生活质量和生存，常见的癌性发热证型包括阴虚型、气虚型、阳虚型、血瘀型、湿热蕴结型、毒热盛盛型和肝经郁热型，治疗主要以清热和补虚为主；Lin[40]等通过对药物的先验关联分析得到治疗癌性发热的主要相关药物为地黄、牡丹皮、蒿属药材、鳖甲和知母，前5位的灰色关联度则为补骨脂、柴胡、沙棘、黄芩和马尾草。有证据表明[41]，中药外敷结合三步止痛疗法治疗原发性肝癌疼痛的临床疗效优于单纯三步止痛疗法，可有效缩短疼痛缓解的起效时间，降低VAS和NRS疼痛评分，减少吗啡用量和疼痛爆发次数。

5 讨论与展望

原发性肝癌的治疗方法多样，但目前临床仍以手术治疗、化疗、放疗和靶向治疗4种疗法为主。根据2018版《CSCO原发性肝癌诊疗指南》专家推荐[42]，Ia-IIb期肝癌患者首推手术切除，IIIa-IIIb期部分情况下也可考虑手术，术后辅助治疗则包括TACE、胸腺肽α-1、槐耳颗粒治疗以及单药、联合化疗或索拉非尼治疗等。程树群等曾就常见的肝癌伴门静脉癌栓的分型及诊治提出建议[43]：微血管内癌栓或镜下癌栓可通过手术根治，位于门静脉三级分支、二级分支甚至门静脉主干内的IIIa型癌栓若符合手术指征，也应首选手术治疗；IIIb型和IV型癌栓因手术疗效不佳，建议行TACE加局部放疗。作为治疗肝癌的新型靶向药物之一，Hsiao[44]等通过Kaplan-Meier分析发现，索拉非尼与TACE多线治疗、索拉非尼三线治疗与不使用索拉非尼多线治疗的中位总生存期明显优于索拉非尼单独治疗。然而，几乎所有的现代治疗都面临着复发转移这一瓶颈，中药的多样性和个体化治疗原则为解决这一难题提供了某种可能。Liu[45]等通过COX多因素分析发现，中药治疗是肝癌患者5年生存的独立保护因素，Kaplan-Meier曲线则提示采用中药治疗患者的总生存率和无进展生存率高于纯西医治疗患者；最常被使用的中成药为复方斑蝥胶囊、槐耳颗粒和金龙胶囊。Wang[46]等对含丹参方剂联合化疗的临床RCT进行分析，结果表明丹参方联合化疗治疗肺癌、白血病、肝癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌优于单纯常规药物治疗方案。以上研究均提示，应用中药辅助治疗肝癌可能延长中位生存期，提高患者的整体生存率。但目前中药治疗肝癌复发转移的基础研究仍较为片面，多针对单味药物或方剂的有效成分，涉及某一或少数几个信号通路，与临床实践中药物配比组合和治疗目的的多样性，以及个体化治疗的中医理念存有差距。因此，与现代基因组学、蛋白组学等系统生物学研究方法相结合，全面阐释中药治疗肝癌复发转移机制势在必行。与临床理念相结合，从多靶点、多途径、多系统加强研究中药有效成分抗肝癌复发转移机制，将成为今后中医药防治肝癌复发转移的研究重点。