不同手术时机高血压脑出血患者外周血及脑组织TGF-β1、NF-κB表达的差异

崔植野 李湖广

高血压脑出血是临床上常见的脑血管疾病，与脑内动静脉病变破裂出血相关，具有较高的致残率和致死率[1]。近年来，高血压脑出血发病率和病死率呈升高趋势，严重影响患者生活质量[1-2]。在治疗方面，临床上常采用开颅血肿清除术且有一定的治疗效果。研究表明，手术干预时机可能会影响手术效果及预后，目前关于手术时机尚无统一的观点[3-4]。转化生长因子-β1（transforming growth factor 1,TGF-β1）、NF-κB 是评估炎症相关疾病严重程度及预后的重要指标[5]。研究表明，下调TGF-β1 mRNA表达可抑制脑微血管内皮细胞的凋亡，改善缺氧损伤[6]。而抑制NF-κB表达可减轻脑出血后的细胞凋亡，保护脑神经[7]；另一方面，高血压脑出血后不同时期NF-κB表达具有时相性，但NF-κB在出血过程中的作用并不明确[8]。因此，本研究探讨了不同手术时机高血压脑出血患者外周血及脑组织TGF-β1、NF-κB的表达，以期为该病手术治疗时机的选择提供参考，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年4月至2017年8月在上海市浦东新区周浦医院经头颅CT影像学检查且符合全国第四届脑血管病学术会议相关诊断标准的高血压脑出血患者245例，其中手术时机为超早期（出血后＜8 h）105例、早期（出血后8～24 h）95例、延迟（出血后＞24 h）45 例。3 组患者性别、年龄、BMI、高血压病史、收缩压、舒张压、饮酒史、吸烟史、脑出血量、术前格拉斯哥昏迷评分（GCS）、手术方式等临床资料比较，差异均无统计学意义（均 P＞0.05），见表 1。纳入标准：（1）符合高血压脑出血的诊断标准：血压控制不满意，未使用抗高血压时的收缩压140 mmHg、舒张压90 mmHg，脑压增高，Babinski征阳性；（2）首次发生脑出血；（3）发病时间72 h内；（4）2个月内未服用过激素或免疫抑制剂等药物。排除外伤性脑出血、静脉畸形脑出血、动脉瘤、脑疝及肿瘤破裂脑出血患者。本研究经医院医学伦理委员会审查通过，所有患者或家属签署知情同意书。

表1 3组患者临床资料比较

1.2 方法

1.2.1 手术方法 （1）小骨窗开颅血肿清除术：患者全麻下，在最靠近血肿的颅骨处作5 cm左右的切口，使用电钻张开一个半径约2.0 cm的圆形骨窗，穿刺，沿穿刺针清除血肿，缝合切口。（2）微创血肿清除术：患者局麻下，穿刺针沿着电钻进入颅骨，穿透后取电钻，在血肿位进行引流，利用注射器清除血肿，拔出穿刺针。（3）开颅血肿清除术：患者全麻下行去骨瓣血肿清除术，取足够大的骨瓣，打开硬脑膜，自颞中回切开作一个约1.5 cm的入口，深入血肿并清除血肿，电凝止血，修补硬脑膜，缝合。

1.2.2 外周血和脑组织取材方法 确诊后立即取患者外周血5 ml。患者入手术室麻醉后，切开头皮，止血后分离皮瓣，显露骨窗，留取少量出血皮质区脑组织作为出血区标本，留取清除血肿旁约1 cm的周围脑组织为非出血区标本。

1.2.3 外周血及脑组织TGF-β1、NF-κB mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取0.5 ml外周血或0.1 mg脑组织（其中脑组织置于匀浆器中），加入1 ml Trizol试剂，使用氯仿、异丙醇法提取总RNA，使用紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260/A280为1.8～2.0。按RT-PCR试剂盒（货号：K1622，加拿大Fermentas公司）说明书进行操作，将RNA逆转录为cDNA。引物由上海生工生物技术有限公司合成，各引物序列见表2。RT-PCR反应条件：94℃预变性30 min；94℃变性15 min，60℃退火15 min，72℃延伸10 s，共40个循环。以-actin为内参，采用 2-ΔΔCt法计算 TGF-β1、NF-κB mRNA 相对表达量。

表2 各引物序列

1.2.4 脑组织TGF-β1、NF-κB蛋白表达检测 （1）定性检测：采用免疫组化Envision二步法。取部分脑组织标本，制备石蜡切片，脱蜡至水，3% H2O2室温孵育10 min；PBS 冲洗，滴加抗大鼠 CD34（1∶200，批号：bs-0646R，北京博奥森生物技术公司）、兔抗人TGF-β1抗体（1∶200，批号：JM-4342-5，海浩洋生物科技有限公司）、兔抗人NF-κB 抗体（1∶200，一抗，批号：sc-10791，海浩洋生物科技有限公司），室温过夜；PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗（1∶400，批号：PL03b0371R，海浩洋生物科技有限公司），室温孵育30 min；PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素；PBS冲洗，二氨基联苯胺（DAB）显色。在CX23型显微镜（日本OLYMPUS）下观察，以细胞核或细胞质内有棕黄色颗粒为阳性细胞。（2）定量检测：采用Western blot法。采用RIPA蛋白裂解液法提取脑组织总蛋白，考马斯亮蓝法测定脑组织的蛋白质。取核蛋白样品加入等体积的电泳样品缓冲液加热变性，取20 g蛋白上样泳道，电泳后，转移至硝酸纤维膜，采用5%脱脂奶粉封闭，递次地加入NF-κB抗体（1∶300，鼠抗人，批号：8242，美国 Cell Signaling公司）/TGF-β1抗体（1∶300，鼠抗人，批号：RS-0103R，上海研晶实业科技有限公司）的一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶4 000，羊抗鼠，批号：7056，美国 Cell Signaling公司），以 DAB显色，采用Gel Doc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）定量扫描灰度值，以TGF-β1/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、NF-κB/GAPDH 分别表示 TGF-β1、NF-κB的蛋白相对表达量。

1.3 术后并发症统计 观察并记录3组患者术后消化道出血、肺部感染和颅内感染等并发症发生情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较 3组患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；其中超早期组外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量最低，早期组其次，延迟组最高（均P＜0.05），见表3。

表3 3组患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较

2.2 3组患者脑组织TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较 3组患者脑组织TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；其中超早期组脑组织TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量最低，早期组其次，延迟组最高（均P＜0.05），见表4。

表4 3组患者脑组织TGF-β1、NF-κB mRNA相对表达量比较

2.3 3组患者出血区和非出血区脑组织TGF-β1、NF-κB蛋白相对表达量比较 3组患者脑组织出血区和非出血区TGF-β1、NF-κB蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；其中超早期组脑组织出血区和非出血区TGF-β1、NF-κB蛋白相对表达量最低，早期组其次，延迟组最高（均P＜0.05），见表5。

表5 3组患者脑组织TGF-β1、NF-κB蛋白相对表达量比较

2.4 3组患者术后并发症发生率比较 3组患者术后发生了不同程度的消化道出血、肺部感染和颅内感染，合计并发症发生率比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中超早期组最低，早期组其次，延迟组最高（均P＜0.05），见表 6。

表6 3组患者术后并发症发生率比较[例（%）]

3 讨论

TGF-β1是具有调节细胞生长和分化作用的细胞因子，在细胞增殖、细胞分化、细胞外基质的代谢调节、细胞表型的调节以及淋巴细胞分化、免疫活性细胞增殖、细胞因子产生等过程中发挥着重要作用[9-10]。在急性脑血管疾病中，TGF-β1通过调节免疫炎症、促进血管生成、抗凋亡、保护神经、修复损伤等途径发挥脑保护的效果[11-12]。当周围神经发生损伤时，TGF-β1表达明显升高，其保护神经的作用主要有以下3点：（1）促进施万细胞增殖、分裂，而施万细胞具有清除、吞噬髓鞘及轴突的溃变残余物及碎屑的作用；（2）诱导巨噬细胞渗出血管，穿过神经内膜，进入损伤神经处，协助施万细胞清除碎屑；（3）髓神经纤维的髓鞘是由神经膜细胞包绕神经元轴突而形成的，有助于增强神经纤维信息传递。TGF-β1降低纤溶酶原启动剂的活性，增加纤溶酶原启动剂抑制剂-1的活性，从而抑制细胞外基质的降解；也可直接增加细胞外基质成分的合成速度，但细胞外基质积聚过多会导致瘢痕生成，抑制髓神经生长，故TGF-β1过高表达也可能对患者预后产生负面影响[13]。

NF-κB在多种细胞中表达，在炎症、细胞凋亡及免疫调节等多种病理、生理过程中发挥作用，NF-κB的异常活化参与多种疾病的发生、发展及转归过程。一方面，NF-κB的适当启动会使机体发生免疫反应，对感染产生应答，刺激膜细胞异常增殖并分泌大量炎症因子，启动的单核巨噬系统亦可发挥炎症效应，增强细胞内的氧化应激水平，起到一定的保护作用[14-16]；另一方面，NF-κB无限制地被启动，大大增强的炎症反应也会促进炎症细胞凋亡，使得免疫细胞“沉默”，降低机体对细菌感染的抵抗力，同时NF-κB还会刺激神经元和内皮细胞释放细胞因子，增强巨噬细胞的渗入，巨噬细胞表达上调又反馈性刺激细胞因子分泌，大量细胞因子可氧化损伤神经元，遏制神经元再生[17]。

王恒等[8]认为高血压脑出血后不同时期的NF-κB表达具有时相性，出血后1 h NF-κB开始表达，24 h达到高峰，持续至72 h降低，但该结果基于大鼠研究，与人类结果可能存在差异。本研究探讨了不同手术时机高血压脑出血患者外周血及脑组织TGF-β1和NF-κB表达，结果显示手术时机推迟，患者外周血及脑组织TGF-β1、NF-κB蛋白及mRNA相对表达量明显升高。笔者分析原因可能是脑组织损伤后，机体迅速启动保护机制，脑组织局部TGF-β1、NF-κB表达上调；随着外周血炎症反应增强，TGF-β1、NF-κB又可通过损伤的血-脑脊液屏障进入血肿周边，外周血TGF-β1、NF-κB表达也随之升高，这可能是造成术后并发症的病理原因[18-19]，与相关文献报道结果类似[20-22]。

综上所述，高血压脑出血患者外周血及脑组织TGF-β1、NF-κB表达可随手术时机推迟而明显升高，术后并发症发生率也明显升高，建议对有手术指征的患者早期进行手术。