HtrA4在子痫前期孕妇胎盘组织中的表达及与滋养细胞缺氧的相关性

徐晓敏 汪文寰 孙聪聪 王叶平 李晓庆

子痫前期（preeclampsia，PE）是指孕妇妊娠20周以后新发高血压伴蛋白尿，病情严重时可发生全身多脏器病变的母胎致病/致死疾病，发病率约为5%～7%[1]。滋养细胞侵袭过浅引起胎盘缺氧，释放多种炎性因子进入母体血液循环，最终导致血管内皮损伤和全身系统性炎症反应，是PE发病的潜在机制[2]。高温必需因子 A4（high-temperature requirement A4,HtrA4）是一类丝氨酸蛋白酶，参与了滋养细胞增殖、侵袭和应激调控[3]。研究表明，HtrA4与PE的发病相关，但其在PE孕妇胎盘组织中的表达水平及调控机制仍不明确[4-7]。而HtrA4表达是否与滋养细胞缺氧关键指标——缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1alpha,HIF-1α）相关也未见报道。本研究通过基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库和胎盘组织验证，明确HtrA4的表达情况，探讨HtrA4表达水平与滋养细胞缺氧及HIF-1α表达的相关性，为基于HtrA4的PE发病机制研究和防治策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 Bewo滋养细胞购自中国典型培养物保藏中心。细胞培养基和FBS均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM3000和逆转录试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司；Matrigel基质胶和Transwell小室均购自美国Corning公司；HtrA4和HIF-1α抗体均购自中国Proteintech公司；MTT试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒均购自中国碧云天生物技术有限公司；氯化钴（CoCl2）购自中国阿拉丁公司。引物和小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片数据分析 通过GEO数据库查询并纳入PE孕妇胎盘组织基因芯片数据集，共计11组。数据纳入标准：（1）人PE或正常胎盘组织；（2）PE组和对照组样本例数均＞5例。采用GEO2R软件[8]筛选数据集中差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。筛选标准如下：（1）P＜0.05；（2）差异倍数（fold change，FC）≥2，即log2（FC）≥1。采用“RobustRankAggreg”R语言包[9]对11组数据集中的DEGs进行合并，筛选共同DEGs。富集分析采用Metascape基因功能分析平台[10]。

1.2.2 胎盘组织验证 胎盘组织采集自2019年1至6月在温州市人民医院行剖宫产分娩的PE孕妇9例（PE组）和无妊娠并发症的择期剖宫产分娩孕妇9例（对照组）。PE组纳入标准：符合《妇产科学》[11]中的PE诊断标准。排除标准：（1）非自然受孕者；（2）双胎或多胎妊娠者；（3）有慢性高血压史、心血管疾病史、肾脏疾病史或糖尿病史者。对照组排除妊娠并发症和合并症的择期剖宫产分娩孕妇。两组孕妇年龄、BMI、孕次、产次比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。胎盘经剖宫产娩出后，取基底层和绒毛膜板间1 cm3组织，预冷PBS冲洗去除血液后，液氮保存。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有孕妇均签署知情同意书。

表1 两组孕妇一般情况比较

1.2.3 细胞培养及siRNA干扰 Bewo滋养细胞采用含10% FBS的Ham's F12k培养基，在37℃、5% CO2和20% O2条件下常规培养。细胞培养至对数生长期，以1×105个/孔接种至24孔板；常规培养至近70%融合时，用无血清培养基清洗细胞，采用LipofectamineTM3000转染细胞，qRT-PCR评估干扰效率，干扰效率≥60%说明干扰成功；HtrA4 siRNA序列：5'-ACUGUACACAGGAACAAGCTT-3'，HIF-1α siRNA 序列：5'-GCUCUUCGACAAGCUUAATT-3'。

1.2.4 细胞增殖实验及侵袭实验 Bewo滋养细胞分别经HtrA4 siRNA（HtrA4 siRNA干扰组）和阴性对照siRNA（阴性对照组）转染后，以未经干扰细胞作为空白对照（空白组），检测细胞增殖和侵袭活性。细胞增殖实验采用MTT法，每组细胞按5×104个/孔接种细胞，分别检测24、48和72 h细胞增殖活性，每个时间点均重复3次，操作严格按照MTT试剂盒说明书。侵袭实验采用Transwell法，每组细胞重悬计数浓度为2×105个/ml；将Matrigel与无血清培养基按照1：8比例混合均匀，加入Transwell小室底部待凝固；小室下孔加入15% FBS的 Ham's F12k培养基，小室中加入200μl无血清的细胞悬液，每组细胞做2个复孔；48 h后，甲醇固定，0.1%结晶紫染色并计数，每组计数4个视野。

1.2.5 细胞缺氧实验 滋养细胞缺氧模型采用低氧（1% O2）诱导和 HIF-1α 激活剂 CoCl2诱导。按 1×106个/孔接种细胞，常规培养48 h后，分为HIF-1α激活组、低氧组和对照组。HIF-1α激活组：采用含200μM HIF-1α激活剂CoCl2的10% FBS的Ham's F12k培养基，37℃、20% O2、5% CO2继续培养 24 h；低氧组：37 ℃、1% O2、5% CO2继续培养24 h；对照组：继续常规培养24 h。为进一步观察抑制HIF-1α对HtrA4的影响，设立缺氧条件下的HIF-1α抑制组，即细胞经HIF-1αsiRNA干扰后，按1×106个/孔接种细胞，常规培养48 h，再在37℃、1% O2、5% CO2条件下培养 24 h。

1.2.6 HtrA4和HIF-1α蛋白表达水平检测 采用Western blot法。使用细胞裂解液将细胞或胎盘组织裂解后，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度；30μg蛋白上样，经15% SDS-PAGE电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h；按照抗体说明书中建议的使用浓度，用TBST配置一抗工作液，并将PVDF膜置于工作液中4℃孵育过夜；TBST溶液漂洗PVDF膜后，加入二抗，室温孵育1.5 h；TBST溶液漂洗，进行显影，Quantity One软件扫描各条带的光密度并分析结果。

1.2.7 HtrA4和HIF-1αmRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。提取细胞或胎盘组织RNA后逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，qRT-PCR法检测样本中HtrA4和HIF-1αmRNA表达水平。HtrA4上游引物：5'-GTCAGCACCAAACAGCG-3'，下游引物：5'-GGAGATTCCATCAGTCACCC-3'；HIF-1α 上游引物：5'-GTTAGTTCAATTTTGATCCCCTTTCT-3'，下游引物：5'-GCTACTGCAATGCAATGGTTTAA-3'。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。采用Pearson相关分析HtrA4与HIF-1αmRNA表达水平的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEGs筛选与富集分析 11组芯片数据集筛选获得13个共同DEGs，其中上调表达基因12个，下调表达基因1个。HtrA4在各数据集中均上调表达，log2（FC）为0.84～2.74，校正后P＜0.05。DEGs及表达量见图1。HtrA4具有分泌活性，参与细胞外基质的形成及调控细胞对生长因子刺激反应，DEGs富集分析结果见表2。

表2 DEGs富集分析

图1 11组芯片数据集中的共同上下调差异表达基因（DEGs）

2.2 两组孕妇胎盘组织HtrA4和HIF-1α表达水平比较 与对照组比较，PE组孕妇胎盘组织HtrA4蛋白和mRNA表达水平均上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与对照组比较，PE组孕妇胎盘组织 HIF-1α mRNA表达水平上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组孕妇HIF-1α蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3和图2。

表3 两组孕妇胎盘组织HtrA4和HIF-1α表达水平比较

图2 两组孕妇胎盘组织高温必需因子A4（HtrA4）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达的电泳图（PE为子痫前期）

2.3 各组细胞增殖和侵袭活性比较 HtrA4 siRNA干扰组（干扰效率为77.84%）、阴性对照组和空白组24、48和72 h细胞增殖活性比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。与阴性对照组比较，HtrA4 siRNA干扰组细胞侵袭活性明显减弱，穿过小室基底膜的镜下细胞数明显减少。与阴性对照组比较，HtrA4 siRNA干扰组侵袭活性下降（64.93±1.46）%，差异有统计学意义（t=44.41，P＜0.05），见图 3。

图3 小干扰RNA（siRNA）干扰高温必需因子A4（HtrA4）对滋养细胞侵袭的影响（a：HtrA4 siRNA干扰细胞后，穿过小室基底膜的镜下细胞数明显减少；b：与阴性对照组比较，HtrA4 siRNA干扰组侵袭活性下降，*P＜0.05）

表4 各组细胞增殖活性比较

2.4 细胞缺氧对HtrA4表达的作用 与对照组比较，HIF-1α激活组、低氧组HtrA4和HIF-1α蛋白、mRNA表达水平均上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与低氧组比较，HIF-1α抑制组（HIF-1αsiRNA干扰效率为61.50%）HtrA4和HIF-1α蛋白和mRNA表达水平均下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5和图4。Pearson相关分析发现各组细胞HtrA4与HIF-1α mRNA表达水平呈正相关（r=0.87，P＜0.01）。

表5 各组细胞HtrA4和HIF-1α mRNA表达水平比较

图4 细胞缺氧对细胞高温必需因子A4（HtrA4）和缺氧诱导因子 -1α（HIF-1α）蛋白表达的影响

3 讨论

HtrA4是促进胎盘滋养细胞侵袭，抑制上皮细胞功能并促进子宫螺旋动脉重塑的关键蛋白[4，7]。本研究对11组PE芯片数据分析及胎盘组织验证的结果显示，PE孕妇胎盘组织HtrA4表达水平明显高于正常妊娠女性，这与文献报道一致[5-7]。笔者对HtrA4 siRNA干扰实验表明，抑制HtrA4表达将下调滋养细胞的侵袭活性，但对滋养细胞增殖活性并无影响。Wang等[4]对HtrA4的体外机制研究认为，HtrA4一方面通过降解细胞基质纤连蛋白来抑制纤连蛋白与整合素受体作用，另一方面通过裂解合胞素-1抑制细胞间融合，促进滋养细胞的侵袭能力。而HtrA4的表达虽然有利于滋养细胞侵袭，但部分研究显示，HtrA4在PE孕妇胎盘中过表达并游离至血清将诱导内皮损伤及抑制内皮正常功能，促进PE发展[12-14]。因此，精确调控HtrA4的表达可能对维持细胞侵袭和抑制PE发展具有重要作用。

目前，HtrA4的调控机制尚不明确，结合HtrA4的基因与蛋白功能和在PE孕妇胎盘组织中表达上调，笔者认为HtrA4可能受细胞应激状态如细胞缺血缺氧等作用，反馈促进细胞侵袭。胎盘缺氧是PE的早期特征之一，胎盘中低氧诱导的转录因子和基因特异性表达是PE发病的核心因素[15-17]。研究显示HIF-1α在PE患者胎盘组织和体内/体外模型中高表达，参与PE发病[18-19]，本研究HIF-1αmRNA验证结果与其一致，但PE组和对照组间HIF-1α蛋白表达水平比较差异无统计学意义，这可能与HIF-1α蛋白表达水平低且易降解有关。Liu等[7]检测滋养细胞HTR-8在1% O2环境下的HtrA4表达水平，结果显示HtrA4在缺氧环境中呈高表达。本研究通过低氧（1% O2）细胞模型实验也证实，缺氧可诱导滋养细胞HtrA4表达上调。进一步采用激动或抑制低氧条件下HIF-1α表达显示，HtrA4表达与HIF-1α相关，部分受其调控。而HIF-1α诱导HtrA4表达的具体机制，有待于进一步研究。

综上所述，本研究证实HtrA4在PE孕妇胎盘组织中表达显著上调，可促进HtrA4的侵袭能力，并发现HtrA4的表达与滋养细胞缺氧和HIF-1α表达水平相关。孕期监测和靶向调控HtrA4的表达可能是防治PE的有效途径。此外，本研究对GEO数据库PE孕妇胎盘组织基因芯片进行分析，得到13个DEGs，其中基因如LEP、FSTL3、PAPPA2 已被证实与 PE 发病相关[20-22]，而较多基因在PE孕妇胎盘组织中的表达和临床意义仍有待于实验验证。