蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白治疗胶原诱导性关节炎大鼠的相关作用机制研究

陈妙月 丁兴红 吴素玲 陈俊松

祖国传统医学中蕲蛇又名尖吻蝮，具有驱风邪、通经络等诸多功效，被证实是治疗风湿痹证的要药，蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白（typeⅡ collagen,CⅡ）是其主要有效活性成分。胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠模型是以慢性、多发性末端关节炎，甚至关节损害等为主要表现的免疫性炎症模型，被应用于关节炎病理生理、免疫机制的研究，以寻求新的治疗靶点和验证新的药物疗法[1]。本文建立CIA大鼠模型，以探讨蕲蛇CⅡ治疗CIA大鼠的相关作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 10周龄、清洁级Wistar雄性大鼠60只，由浙江中医药大学动物实验中心提供；体重（286.5±4.3）g，饲养在标准环境中。

1.2 药物与试剂 弗氏完全佐剂，采用20 ml弗氏不完全佐剂与200 mg卡介苗（批号：200703001，上海生物制品研究所）充分混合制成；蕲蛇CⅡ，采用胰蛋白酶组合微透析等技术从蕲蛇粉末（去内脏、皮骨）中分离提取并用0.9%氯化钠溶液溶解获得20、10、5μg/ml的溶液；塞来昔布（国药准字：J20140072，辉瑞制药有限公司），按36μg/g称取药物溶解于0.9%氯化钠溶液中，获得3.5 mg/ml的溶液。Bovine TypeⅡ Collagen购自美国 Chondrex公司，FBS购自美国 Gibco公司，ConA购自上海源叶生物科技有限公司，D-Hank's液、DMEM、IL-2、IL-4、IL-17、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的ELISA试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，FITC标记的抗大鼠CD4抗体、PE标记的抗大鼠CD25抗体、FITC标记的抗大鼠CD4抗体、PE标记的抗大鼠IL-17A抗体均购自杭州联科生物技术股份有限公司，Percoll细胞分离液购自美国GE公司。

1.3 动物分组与处理 按随机数字表法将60只大鼠分为6组，每组10只，即高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白组、模型组、塞来昔布（对照）组，每组10只。在大鼠右后足爪皮下和尾根部注射牛CⅡ-弗氏完全佐剂乳剂（将弗氏完全佐剂加入等体积的Bovine TypeⅡCollagen中冰浴研磨均匀制成）0.2 ml建立CIA大鼠模型[2]，1周后尾根部追加0.2 ml进行免疫增强；而空白组注射等量的0.9%氯化钠注射液。2周后采用灌胃方式给予药物治疗：高剂量组、中剂量组、低剂量组按10 ml/kg分别给予 20、10、5μg/ml的蕲蛇 CⅡ溶液，对照组按10 ml/kg给予塞来昔布溶液，其余两组按10 ml/kg给予等量的0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续给药30 d。治疗结束后处死大鼠，获得左后足膝关节滑膜组织和肠系膜淋巴结。

1.4 大鼠关节滑膜组织病理学观察 采用HE染色法。取左后足膝关节滑膜组织，经甲醛固定、乙醇梯度脱水、制作石蜡切片、HE染色后在显微镜下观察。采用0～4级评分法评价滑膜病变程度：正常表现为0级；轻微炎症反应，可见少量炎症细胞聚集为1级；局灶性炎症细胞分布，滑膜轻度增生为2级；大量炎症细胞浸润，滑膜明显增生，新生血管增加为3级；炎症细胞浸润明显，滑膜增生明显，血管翳形成，累及关节软骨和周围组织为4级。

1.5 大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞（mesenteric lymph node lymphocytes，MLNLs）分离 将大鼠肠系膜淋巴结放入盛有含5% FBS的D-Hank's液平皿的沙网（200目）中，去除脂肪及结缔组织，然后经组织碾碎、离心分离，最终获得重悬细胞。

1.6 MLNLs中 IL-2、IL-4、IL-17和 TGF-β 水平检测 采用ELISA法。MLNLs悬液用10% FBS-DMEM培养液进行培养，调整细胞浓度为5×109个/L。在无菌的24孔培养板上，每孔加入500μl MLNLs悬液、500μl含ConA（终浓度为5 mg/L）的10% FBS-DMEM培养液，置于37℃、湿度饱和的5% CO2培养箱中培养48 h，2 000 r离心10 min，取上清液，使用ELISA试剂盒检测IL-2、IL-4、IL-17水平。而TGF-β水平检测选择的是5% CO2培养箱中培养8 h的细胞、2 000 r离心5 min后弃上清液、使用D-Hank's液洗涤3次后加入无血清的DMEM培养液继续培养72 h、2 000 r离心10 min获得的上清液，使用ELISA试剂盒进行检测。

1.7 MLNLs中辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）、调节性T细胞（regulatory cell,Treg）细胞比例检测 采用流式细胞术。取1 ml的MLNLs悬液，与1 ml的40% Percoll工作液混合均匀后转至离心管中（含2 ml 70% Percoll工作液），4 ℃、1 200 r离心 20 min，收集淋巴细胞后调整细胞浓度为1×109个/L，用 FITC标记的抗大鼠CD4抗体、PE标记的抗大鼠CD25抗体标记Treg，用FITC标记的抗大鼠CD4抗体、PE标记的抗大鼠IL-17A抗体标记Th17，上流式细胞仪进行检测。

1.8 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠关节滑膜组织病理学观察 造模后，大鼠的滑膜组织细胞体积增大，排列紊乱，炎症细胞浸润，新生血管生成。蕲蛇CⅡ、塞来昔布对炎症反应均有一定的抑制作用，给药后炎症细胞及微血管数量明显减少，见图 1（插页）。

图1 大鼠关节滑膜组织病理学观察（a：正常组；b：模型组；c：对照组；d：高剂量组；e：中剂量组；f：低剂量组；H E染色，×100）

2.2 各组大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比较 各组大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与空白组比较，模型组MLNLs中IL-2、IL-4水平明显降低，而TGF-β、IL-17水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组、中剂量组及对照组MLNLs中IL-2、IL-4、TGF-β水平明显升高，而IL-17水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组MLNLs中IL-2、IL-4、TGF-β水平明显升高，而IL-17水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠MLNLs中IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平比较（ng/L）

2.3 各组大鼠MLNLs中Th17、Treg细胞比例比较 各组大鼠MLNLs中Th17、Treg细胞比例比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与空白组比较，模型组MLNLs中Th17、Treg细胞比例均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组及对照组MLNLs中Th17细胞比例明显降低，高剂量组及对照组Treg细胞比例明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组Th17细胞比例明显降低，Treg细胞比例明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2和图2（插页）。

表2 各组大鼠MLNLs中Th17、Treg细胞比例比较（%）

图2 各组大鼠M LNLs中Th17、Treg流式细胞术检测结果（M LNLs为肠系膜淋巴结淋巴细胞，Th17为辅助性T细胞17，Treg为调节性T细胞）

3 讨论

本团队通过X线检查观察大鼠足趾肿胀程度及致炎关节，已证实蕲蛇CⅡ治疗能缓解大鼠关节的肿胀程度，降低关节软骨的损害，且相关作用具有一定的量效关系；蕲蛇CⅡ对大鼠T淋巴细胞具有免疫调节作用，可调节CIA大鼠外周血CD4＋水平和CD4＋/CD8＋，与剂量呈一定的相关性（待发表）。而本研究通过构建CIA大鼠模型进一步探讨蕲蛇CⅡ治疗CIA的相关作用机制，结果显示蕲蛇CⅡ能明显改善CIA大鼠病变关节的炎症程度，可能是通过对大鼠MLNLs免疫调节机制产生影响而发挥作用的。其中减轻关节炎症可能与蕲蛇CⅡ诱导体内产生口服耐受机制有关。口服耐受是指通过口服方式进食某种蛋白质后，再次摄入时机体发生全身免疫低反应状态[3]。口服抗原的剂量是关系到口服耐受效果的重要影响因素，低剂量的抗原诱导自身反应性淋巴细胞主动免疫抑制，高剂量的抗原诱导克隆清除或克隆无能[4]。Th17、Treg作为2种新型Th细胞亚群，在关节炎自身免疫反应的发生、发展中起关键作用[5]。Treg特异性表达Forkhead家族蛋白3，具有抗炎作用，且在维持机体对自身组织免疫耐受方面发挥重要作用。研究表明，Treg可产生抑制性细胞因子，通过上调抑制性免疫细胞表面分子表达和下调活化T细胞的相关基因来抑制靶细胞诱导的免疫应答[6]。Th17 能分泌产生 IL-17、IL-21、IL-6、TNF-α 等细胞因子，其中IL-17是Th17最重要的效应因子，其受体在体内广泛表达，可诱导其他炎症细胞因子如IL-6、TNF-α等表达，引起炎症细胞浸润和组织损伤。可见，免疫内环境的稳定与上述2种细胞的比例平衡显著相关。本研究结果显示，蕲蛇CⅡ能使CIA大鼠MLNLs中IL-2、IL-4水平升高，且剂量越高效果越明显，高剂量组与塞来昔布的效果类似，可能存在同样的抗炎机制。此外，蕲蛇CⅡ和塞来昔布均能使CIA大鼠MLNLs中Treg细胞比例升高，Th17细胞比例降低，但相关比例较文献报道的数据偏低[7]，可能受实验方法和试剂的影响，亦可能是由于采集的细胞数量不足所致。

综上所述，蕲蛇CⅡ治疗能改善CIA大鼠关节滑膜组织的病理性改变，其作用机制可能是通过调节MLNLs中细胞因子水平和Th17、Treg细胞比例实现的。