蛋白质组学临床转化研究主要进展及在心脏研究领域应用的挑战和展望

王莽原、宋雷综述，霍强、杨毅宁审校

蛋白质是生理功能的执行者，生命现象的直接体现者。蛋白质组是指研究一个器官、组织或细胞内表达的所有蛋白质。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用，是研究这些蛋白质的组成及变化规律的一个学科。上世纪九十年代起的人类基因组学研究基本完成后，发现很多生物学现象仍无法合理解释，因而出现了蛋白质组学这一新生的前沿学科，由澳大利亚学者Wilkins等[1]于1996年最早提出。

1 国内外蛋白质组研究计划

进入新世纪以来，作为后基因组时代的蛋白质组学研究成为了前沿热点研究领域之一，因此国际人类蛋白质组计划应运而生。其中包括中国科学家贺福初院士领衔的“人类肝脏蛋白质组计划”和美国科学家Gibert Omenn领衔的“人类血浆蛋白质组计划”，“人类肝脏蛋白质组计划”已于2014年6月升级为“中国人类蛋白质组计划”，目前已有胃癌[2]、肝癌[3]、肺腺癌[4]三方面的临床转化的研究成果，将来还要在更多中国常见疾病领域研究蛋白质组临床转化研究，以驱动多种常见疾病的精准治疗，而“人类血浆蛋白质组计划”目前尚未有高质量的临床转化研究成果，因此“人类肝脏蛋白质组计划”大幅度领先于“人类血浆蛋白质组计划”；然而，美国临床蛋白质组肿瘤分析协会（CPTAC）也在乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、结直肠癌[7]、肾透明细胞癌[8]、肺腺癌[9]等方面有蛋白质组和基因组筛查结合分析的研究成果，因此，蛋白质组学在中国的发展一直保持着与国际齐头并进的态势，甚至在部分领域引领蛋白质组学的发展。

2 单细胞蛋白质组学的最新进展

目前单细胞蛋白质组学处于起步阶段[10-11]。在单细胞分离方面，郭国骥团队对60种人体组织样本和7种细胞培养样本进行了单细胞分离和Microwell-seq高通量单细胞测序分析，系统性地绘制了跨越胚胎和成年两个时期，涵盖八大系统的人类细胞图谱[12-13]。在单细胞蛋白质组学技术建立方面，Budnik等[14]建立了基于质谱检测的哺乳动物单细胞蛋白质组学检测。目前尚缺乏高质量的应用单细胞蛋白质组学进行临床转化解决临床实际问题的研究。

3 蛋白质组学临床转化研究主要研究进展

3.1 “中国人类蛋白质组计划”主要的临床转化研究成果

秦钧教授的研究检测到癌症组织和癌旁组织对比的差异蛋白质通路富集到细胞周期（代表肿瘤细胞增殖）、上皮间质转化（EMT，代表肿瘤细胞转移）、免疫（代表肿瘤细胞免疫豁免）中的普遍表达丰度分为PX1（肿瘤细胞高增殖、低转移、低免疫豁免）、PX2（肿瘤细胞高增殖、高转移、低免疫豁免）、PX3（肿瘤细胞低增值、高转移、高免疫豁免），并发现PX1的临床预后最好，PX2的临床预后其次，PX3的临床预后最差且对化疗不敏感，并发现CD300A、CYBA、IDO1三个蛋白质的高表达在临床上的预后均比低表达组预后更差，而这几个蛋白质可以作为弥漫型胃癌患者（尤其是弥漫型胃癌PX3型患者）潜在的免疫治疗的靶点[2]；之后，贺福初院士团队研究了关于人肝癌和人肺腺癌基于不同临床预后的蛋白质分子临床分型，根据蛋白质表型对不同预后的肝癌患者和肺癌患者进行分期并将早期患者筛查出来[3-4]。

3.2 CPTAC主要的临床转化研究成果

2020年CPTAC研究在110个肺腺癌肿瘤组织和相匹配的101个正常的癌旁组织中进行了基因组学、表观遗传组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、乙酰化蛋白质组学多组学数据综合分析，发现 了PTPN11（EGFR）、SOS1（KRAS）、neutrophil degranulation（STK11）三种肺腺癌候选药物靶点[9]。2019年CPTAC研究在103例肾透明细胞癌病例中进行了基因组学、表观遗传组学、转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学多组学数据综合分析，发现了肾透明细胞癌特异的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学改变，并明确了该肿瘤的免疫分型[8]。2016年CPTAC研究描述了105例乳腺癌的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的定量质谱分析，其中77例提供了高质量的数据，CDK12、PAK1、PTK2、RIPK2、TLK2等磷酸化激酶被鉴定出；研究表明蛋白质组学和基因组学结合分析阐明了乳腺癌体细胞突变的功能后果，确定了乳腺癌的治疗靶点[5]。同年CPTAC的又一项研究在174个卵巢肿瘤组织中进行了蛋白质组学、基因组学、表观遗传组学多组学数据结合分析，阐明了特异性蛋白质乙酰化可作为对患者进行治疗分层的一种潜在方法[6]。2014年CPTAC研究在结直肠癌肿瘤组织中进行了蛋白质组学和基因组学多组学数据结合分析，阐明了染色体20q上的HNF4A、TOMM34、SRC在肿瘤组织中的mRNA和蛋白质层面都有最显著的改变；基因组学和蛋白质组学结合分析为揭示基因组异常提供了蛋白质功能学背景，为理解结直肠癌肿瘤生物学提供了新的模式[7]。

3.3 心脏研究领域蛋白质组学主要研究进展

目前心脏研究领域的蛋白质组学研究尚处于起步阶段，Doll等[15]的研究阐述了心脏16个解剖区域的3种主要心脏细胞类型的蛋白质组学特征，并根据心脏细胞不同的细胞器建立了亚细胞水平的心脏蛋白质组模型，进而揭示了心房颤动线粒体功能障碍的个体差异。有研究通过对100例实体解剖的年轻人冠状动脉和主动脉标本进行质谱蛋白质组分析，描述了与早期动脉粥样硬化密切相关的人类动脉蛋白质组和蛋白质组学特征，证明了在早期动脉粥样硬化中线粒体蛋白丰度存在显著地降低，以及鉴定出一系列血浆蛋白（VTN、TGFBI、C7、ITIH1、TPP1、LTA4H、APOB）可以高质量（AUC=0.93）预测经动脉造影证实的冠心病[16]。

另外，有少量文献报道了心脏研究领域的尿蛋白质组学研究。尿液在临床上十分便于收集，因此尿蛋白质组学研究最大的优势便在于此，近二十年来心脏研究领域的尿蛋白组研究呈逐渐增长的趋势，尤其在2013年蛋白筛查实验技术路线确定及质谱仪器日臻完善之后[17]心脏研究领域的尿蛋白组研究呈大幅度增长，尿蛋白质组研究主要应用于以下心脏研究领域：尿蛋白质组研究舒张期心力衰竭早期诊断标准和生物标记物[18]，该研究使用了毛细电泳-质谱联用技术，比较了19例无症状左心室舒张功能不全的高血压患者和19例健康对照者，将85个潜在的生物标志物组合在高维模型分类器中，结果显示舒张型心力衰竭的ROC曲线AUC为0.84（95% CI：0.70～0.98，P=0.001）；尿蛋白质组研究收缩期心力衰竭早期诊断标准和生物标记物[19]，该研究使用了毛细电泳-飞行时间质谱联用技术，对比了总计126例根据年龄、性别和肾功能匹配的59例左心室射血分数降低的心力衰竭患者和67例对照者，总共识别出107个显著差异的肽段，并使用基于支持向量机的分类器，最后将该分类器应用于25例左心室射血分数降低的心力衰竭患者和33例对照受试者的测试队列，结果显示该诊断方法的敏感度为84%，特异度为91%，测序结果显示大部分肽段是Ⅰ型和Ⅲ型胶原的片段；尿蛋白质组研究冠心病早期诊断和生物标记物[20-21]，研究通过对84例患者和84例匹配对照者的蛋白质组学分析，发现了75条鱼急性冠状动脉综合征相关的尿肽段，据此研究建立了急性冠状动脉综合征预测因子（ACSP75）。

4 蛋白质组学技术在心脏研究领域应用的挑战及解决方法

如前所述，蛋白质组学技术在肿瘤领域的应用已经有很大发展[2-4]，相比于此，目前蛋白质组学技术在心脏领域的应用尚进展缓慢，这主要是因为蛋白质组学技术在心脏研究领域的应用存在一定的困难：

第一方面，心脏组织取材困难，心脏组织不同于肿瘤组织，尤其最有研究意义的心室部分和正常心脏组织，在心脏一般手术中无法取材，只有通过心脏移植手术的患者受体心脏，才可多层面、多部位的系统性取到心脏组织以供研究[22]，而能进行心脏移植手术的医院以及心脏移植的病例数量都十分有限[23-24]，大幅度限制了心脏领域利用蛋白质组学技术进行的临床转化研究。

第二方面，人心室壁组织和大动脉组织坚韧，提取出的细胞核蛋白质纯度低，其中混杂的细胞质蛋白很多，从而引起转录因子检出率和覆盖度低：人类右心室壁心肌转录因子高通量筛查仅能筛查到数种至数十种转录因子，而之前有研究显示在人类心脏组织中使用RNA测序筛查转录因子可检测到近200种转录因子[25]。

为了解决人心室壁组织和大动脉组织坚韧导致提取出的细胞核蛋白纯度低的问题，需要将人类心脏新鲜组织消化为细胞，而中国医学科学院阜外医院胡盛寿院士团队和聂宇研究员团队在2018年和2020年分别提出了将人类和小鼠心脏新鲜组织消化为细胞的改进方法，这种方法有效消化分离了心肌组织中的细胞，并保持了分离的细胞的活性，以及保持了心脏疾病的表型，为研究各类心肌疾病提供了良好的细胞模型[26-27]。再提取消化后细胞的细胞核蛋白，之后再进行蛋白质组学实验技术研究，如此即可解决细胞和蛋白纯度低的问题，进而使得蛋白质组学实验技术可以检测到足够的蛋白质种类数，以达到满意的高通量筛查检测覆盖度。

5 蛋白质组学技术在心脏研究领域应用的展望

中国人类蛋白质组计划将分三个阶段展开：第一阶段，全面揭示肝癌、肺癌、胃癌等疾病所涉及主要的组织器官的蛋白质组，了解疾病发生、发展的蛋白质组学主要特征，进而研制诊断试剂、筛选药物，目前这一阶段已基本完成；第二阶段，争取覆盖中国人的其他常见疾病，提升中国人群疾病的防治水平；第三阶段，实现人类更多疾病的覆盖。目前中国人类蛋白质组计划正处于第二阶段的起步阶段，而心血管疾病（比如高血压、终末期心力衰竭、心肌梗死、心房颤动等）是中国人的常见多发疾病，而且病情重、社会资源占用多[28-29]，非常有必要对其进行蛋白质组学驱动的精准医疗转化研究，将会是中国人类蛋白质组计划下一阶段的重要组成部分之一。因此本综述此部分主要展望中国人类蛋白质组计划第二阶段心血管疾病领域部分可能会有较大突破的方面。

5.1 致心律失常性心肌病的蛋白质组临床蛋白质分子分型研究

2019年，胡盛寿院士和宋江平团队的研究[30]结合致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy，AC）的桥粒、非桥粒或其他基因突变及在左心室前壁、左心室侧壁、左心室后壁、室间隔、右心室前壁、右心室后壁纤维脂肪替代心肌的情况，将AC分为了4个亚型：第一个亚型是桥粒基因突变，病变主要为脂肪替代，主要发生在右心室和左心室后壁；第二个亚型是非桥粒基因突变，主要发生在右心室前壁（主要是脂肪替代）和左心室（广泛地轻度纤维替代）；第三个亚型包含了Desmoplakin基因突变，左心室病变情况较重（尤其是左心室后壁）；第四个亚型的基因突变尚未知，纤维脂肪替代病变主要发生在左心室（尤其是左心室后壁），是典型的左心室型AC。并且该研究发现心电图V1～4胸导联的QRS波群振幅可以用来预测AC患者的预后。该文最大的突破和创新点是阐明了AC心室壁内中外层分别的病变特点及与突变基因相关的病理分型，尤其是首次利用心脏移植受体心脏明确地阐述了左心室型AC心室壁内中外层分别的病变特点及与突变基因的关系；显示即时在心室壁内层依然存在纤维脂肪替代的病变，而且左心室型AC高于心脏其他部位（尤其是室间隔）的主要左心室后壁纤维脂肪替代病变在心室壁内层也显著高于其他部位（尤其是室间隔）心室壁内层的存在。然而，在临床上每个左心室型AC患者的预后千差万别，AC已知的基因突变只能用来协助诊断或预测获得右心室型AC的风险，尚没有指标能有效预测左心室型AC的预后，而利用心内膜活检并将活检组织进行蛋白质组学检测则能很好地直接解决这一临床问题。因此可以进行左心室型AC的蛋白质组临床蛋白质分子分型的研究。在左心室型AC患者中进行左心室后壁和室间隔的心内膜活检，左心室后壁的活检组织作为病变组，室间隔的活检组织作为无病变的对照组，两组均进行蛋白质组学的总蛋白高通量筛查，根据病变组和对照组之间对比出的差异蛋白的通路富集分析在细胞凋亡、纤维和脂肪形成方面的蛋白质表达峰度将患者分为高细胞凋亡纤维脂肪形成的预计预后差组和低细胞凋亡纤维脂肪形成的预计预后好组，接着再随访这两个组，以死亡或者心脏移植为临床终点观察预计预后差组是否比另一组的预后显著差。该研究后续还可进行多地区、多中心、更多样本量的验证研究，以验证该蛋白质组学分型方法的准确性。

5.2 心肌再生关键转录因子及相关信号通路机制的研究

自从2011年Porrello等[31]的研究发现了新生小鼠刚出生的一段时间内的心尖有完全再生能力，以及2018年Ye等[32]的研究发现了新生猪刚出生的一段时间内的心脏也有再生能力，心脏再生领域便从研究斑马鱼心脏再生进入了研究哺乳动物心脏再生的新阶段，意味着离人类临床转化越来越更近一步，也意味着有大量转录因子和相关信号通路机制再需要进一步验证和研究，这给蛋白质组学转录因子高通量筛查实验和后续生物学验证及相关信号通路机制的研究提供了施展的机会。目前作者已经筛查并初步验证出候选关键转录因子并已得到候选关键转录因子的通路富集结果[33]，将来有望通过基因敲除小鼠的生物学验证确认这个关键转录因子的结论，并根据通路富集结果为线索，探讨这个关键转录因子相关的信号通路机制。这个研究的临床意义在于心肌再生的关键转录因子及相关信号通路分子可作为心脏再生医学治疗的候选干预靶点。

5.3 心房颤动关键转录因子研究

蛋白质组学研究方法在将来也可用于研究心房颤动关键转录因子的高通量筛查和生物学验证及信号通路机制的基础研究，研究大致的技术路线图与心肌再生关键转录因子及相关信号通路机制研究的类似。目前，已有一些转录因子被证实在房颤的发生、发展中起关键作用，比如ETV1[34]、PITX[35-37]、NFKB[38]、PPARs[39]。但房颤发生、发展的分子机制尚未完全清楚。该研究的临床意义在于心房颤动的关键转录因子及相关信号通路分子可作为治疗心房颤动新药研发的候选干预靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突