中医失眠证候模型的研究述评

叶钰娟，李昕蓉，曹梦琪，邹依纯，马 翠，严兴科

(甘肃中医药大学针灸推拿学院，兰州 730000)

失眠是临床常见病、多发病，是以不能获得正常睡眠且影响日间工作及日常生活为临床特征的一类疾病[1-2]。长期失眠易损害机体健康，影响人们的生活质量及工作效率[3]。中医药是临床防治失眠的有效方法之一，能够显著增加失眠患者入睡时间，改善睡眠质量[4]。近年来，中医药干预失眠的机制研究日益深入[5]，中医失眠证候模型的制备在失眠机制研究中具有重要意义[6]。目前常见的失眠动物模型复制以啮齿类动物如大、小鼠为主[7-8]，主要因其与人类的神经调节和睡眠机制相似，且可操作性强，在神经系统类疾病动物模型的制备中应用广泛[9]。当前关于中医失眠证候模型的制备主要以肝郁型、心肾不交型和阴虚型为主，其他证候类型报道较少；其复制方法主要有应激为主的物理方法和以药物注射为主的化学方法，现就相关内容述评如下。

1 肝郁气滞、肝郁化火型

1.1 物理方法

1.1.1 夹尾刺激+快速眼动睡眠(REMS)剥夺法 肝郁致瘀，血瘀证与血浆中血管舒张剂前列环素(epoprostenol，PGI2)、血管收缩剂血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的水平密切相关，且通过观察血浆中PGI2和TXA2的稳定代谢产物6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)和血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)的变化，可反映PGI2、TXA2的水平[10]。游秋云等[11]采用夹尾刺激+REMS剥夺法复制肝郁失眠证候大鼠模型。模型复制后监测发现，大鼠总睡眠时间减少，且昼夜节律紊乱，提示大鼠处于失眠状态；同时出现眼色暗红、活动减少、激惹回避等类似临床肝郁表现，且血浆中TXB2含量显著升高，6-keto-PGF1a含量明显降低，说明肝郁失眠模型造模成功；随后研究者采用舒郁安神方灌胃，上述症状及异常指标明显改善，“以方测证”佐证肝郁型失眠模型成功复制。

“以方测证”依据方剂或组成药物的功效，推测或反证对应证候的属性[12]。由于动物模型复杂性及不确定性，该法为佐证中医证候动物模型制备的常用方法。

1.1.2 改良小平台水环境间断睡眠剥夺法 卢岩等[13]用改良小平台水环境间断睡眠剥夺法[14]复制肝郁失眠大鼠模型，模型组大鼠出现睡眠时间减少、兴奋性提高，同时大鼠警觉性、进攻等行为提高，出现易激惹、精神萎靡、毛发杂乱无光泽等类似临床肝郁表现，且大鼠丘脑内5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)含量降低，去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)含量明显升高，说明本模型成功模拟了临床肝郁失眠特征。同时“疏肝调神”针法干预后上述指标均有改善，进一步证实肝郁证失眠大鼠模型成功复制。

1.1.3 慢性束缚法+复合慢性疼痛刺激法 何林熹等[15]采用慢性束缚法复合慢性疼痛刺激法复制肝郁化火证失眠大鼠模型，发现大鼠24 h自发活动量显著增加且睡眠节律紊乱，伴有高度紧张、具有攻击性、目光焦灼、耳廓干焦、鼻尖及四肢趾端发红等类似临床肝郁化火表现，同时蓝斑核去甲肾上腺素转运蛋白(norepinephrine transporter，NET)平均光密度值和血浆NE含量显著升高，提示蓝斑核处于兴奋状态，与动物的宏观表征相符，说明此模型符合临床肝郁化火证失眠特征；且采用龙胆泻肝汤合朱砂安神丸作为治疗药物可有效缓解上述症状及指标，佐证肝郁化火证失眠模型成功复制。

1.1.4 电栅刺激法 李越峰等[16]采用电栅刺激法复制肝郁失眠大鼠模型，模型复制后大鼠出现慢波睡眠第1期(SWS1)、慢波睡眠第2期(SWS2)及总睡眠时间(TST)减少，且脑电图(EEG)和肌电图(EMG)显示大鼠觉醒时间明显增多。查阅文献发现，电击可以使大鼠出现易激怒、好斗等类似于临床肝郁的体征[17]，表明该法成功模拟临床肝郁失眠特征。同时研究者[16]采用四逆散冻干粉灌胃后，上述指标均有改善，提示肝郁证失眠大鼠模型复制成功。模型复制过程中用EEG、EMG有创性操作作为检测睡眠状况指标，在植入动物体内对其睡眠会造成不同程度影响[18]。

1.2 化学方法

1.2.1 慢性夹尾刺激和腹腔注射PCPA复合因子法 朱洁等[19]采用慢性夹尾刺激和腹腔注射对氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,PCPA)复合因子方法复制肝郁证失眠大鼠模型，刺激后大鼠出现睡眠节律消失且活动及进食明显减少，毛发散乱枯燥、胡须下垂等症状；同时大鼠的肝细胞超微结构改变，全血黏度及NE含量显著升高，5-HT含量明显降低，动物宏观体征类似临床肝郁失眠特征；采用酸枣仁汤作为佐证药物，发现上述微观指标显著改善，说明肝郁证失眠大鼠模型成功复制。

1.2.2 腹腔注射PCPA 刘倩等[20]采用腹腔注射PCPA复制肝郁证失眠大鼠模型，造模后大鼠出现入睡率显著降低，伴有兴奋、烦躁、易激惹等类似临床肝郁的症状，大鼠脑内5-HT含量明显降低，模型符合肝郁失眠临床实际。采用调和肝脾方(组成:柴胡、黄芩、干姜、合欢皮等)干预后上述症状及指标有所缓解，佐证肝郁证失眠模型复制成功。

2 心肾不交证失眠型

2.1 物理方法

水环境小平台法：全世建等[21]采用水环境小平台法复制心肾不交证失眠模型[22]，模型制作后发现大鼠入睡率降低，伴有喜扎堆、贴边、眯眼、精神萎靡等症状，且中枢神经递质GABA水平显著降低，增食素Orexin A水平明显升高，说明该模型符合临床心肾不交型失眠特点；采用交泰丸干预后，相关指标改善，表明心肾不交证失眠大鼠模型成功复制。

2.2 化学方法

2.2.1 腹腔注射PCPA 赵俊云等[23]采用腹腔注射PCPA复制心肾不交证失眠大鼠模型，造模后，下丘脑-垂体-肾上腺(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA轴)较活跃，血清肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor,CRF)、血清酶DNA甲基转移酶1[DNA (cytosine-5)-Methyltransferase 1，DNMT1]活性上升，说明腹腔注射PCPA可引起大鼠HPA轴激素水平上升，提示大鼠处于失眠状态；采用交泰丸灌胃后上述指标显著下降，进一步佐证心肾不交证失眠大鼠模型建立。

2.2.2 母乳鼠分离法+多种焦虑刺激+PCPA 研究表明，幼年期强烈应激会导致成人期出现心肾不交证失眠，母乳鼠分离法能够很好地模拟这一刺激[24-25]。郜红利等[26]采用母乳鼠分离法、多种焦虑刺激+腹腔注射PCPA复制心肾不交证失眠大鼠模型，刺激后大鼠睡眠时间显著减少，且出现目光呆滞，双眼及口唇苍白，皮毛枯槁蓬乱，同时血浆中促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing，CRH)水平显著性升高，表明该实验成功模拟了心肾不交证失眠大鼠HPA轴内分泌紊乱特点。

2.2.3 复合刺激+PCPA 杨钰涵等[27]在腹腔注射PCPA[28]和多因素共同作用[26]基础上复制心肾不交证失眠模型，随后发现大鼠睡眠时间减少，伴精神萎靡、毛发枯槁且易脱落、反应迟钝、爪甲冰凉等符合心肾不交证临床症状；ELISA方法检测发现，ACTH、CRH均升高，提示HPA轴激活。全世建等[29]发现，交泰丸“交通心肾”的作用机理是其对HPA轴的ACTH、CRH，从而提示心肾不交证失眠模型的成功复制。

3 阴虚型失眠

3.1 化学方法

3.1.1 腹腔注射PCPA 研究者发现，良好睡眠有助于机体发挥抗氧化应激效应[30]。Trx系统主要由还原型辅酶II(nicotinamide adenosine denucleotide hydro-phosphoric acid，NADPH)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TrxR)组成。在NADPH、TrxR的催化作用下，Trx可以保持还原型状态。TrxR的活性以及表达量直接影响还原型Trx的生成，进而影响机体抗氧化过程[31]。谢光璟等[32]采用腹腔注射PCPA法复制阴虚证失眠模型，造模后大鼠24 h昼夜自主活动节律紊乱，伴有兴奋性显著增高，且下丘脑细胞内氧化应激相关蛋白NADPH、Trx1阳性细胞显著减少，TrxR1表达明显增加，以上宏观症状符合临床阴虚失眠体征；同时天王补心丹干预后，上述症状及指标明显改善，佐证阴虚证失眠模型成功复制。

3.1.2 咖啡因腹腔注射叠加多平台水环境持续睡眠剥夺法 黄攀攀等[33]采用咖啡因腹腔注射+多平台水环境睡眠剥夺法复制失眠大鼠模型，模型复制后大鼠出现睡眠时间明显减少，同时力竭游泳时间缩短，且精神萎靡、双目及口唇苍白、皮毛重度枯槁蓬乱、爪甲粗糙，说明阴虚失眠大鼠模型复制成功；天王补心丹干预后上述症状明显缓解，提示阴虚证失眠模型复制成功。

3.1.3 甲状腺素片混悬液灌服 Xiong等[34]采用甲状腺素片混悬液20.5 mg(kg/d)-1灌服法复制阴虚证失眠模型，发现大鼠自发活动、饮水量、进食量显著增加，体质量显著降低，其整体症状符合心阴虚证中心悸、怔忡、不寐等证候，提示甲状腺素片混悬液灌服法可以复制阴虚证失眠模型。

4 阳虚型失眠

4.1 化学方法

4.1.1 腹腔注射PCPA+切除产热物质 韦祎等[35]采用“BAT切除术”复合PCPA腹腔注射法复制脾阳虚证失眠模型，观察发现大鼠昼夜活动增多，且出现畏冷寒战、喜扎堆、拱背少动、体毛不荣等阳虚症状，orexin mRNA表达含量升高，5-HT含量降低，提示阳虚失眠模型成功制备；附子理中汤灌胃后上述症状及指标均有改善，佐证阳虚证失眠模型复制成功。

4.1.2 腹腔注射PCPA+肌肉注射氢化可的松 王志鹏[36]采用腹腔注射PCPA+肌肉注射氢化可的松方法复制阳虚失眠大鼠模型，发现模型组大鼠毛发杂乱、昼夜节律消失，畏缩蜷卧，易激惹、尾温降低，尾、爪皮肤苍白等类似于临床阳虚症状，且脑组织中5-HT、NE含量升高，表明阳虚失眠模型成功制备。经桂甘龙牡汤灌胃后上述症状及指标均显著改善，佐证阳虚证失眠模型复制成功。

5 讨论及展望

复制失眠证候模型是中医治疗失眠机制研究的重要手段和载体。常用失眠证候模型制备以物理方法(水平台环境法、快速动眼睡眠剥夺法、电栅刺激、慢性束缚法复合慢性疼痛刺激法)和化学方法(腹腔注射PCPA)为主，临床上失眠类型以肝郁型、心肾不交型、阴虚型和阳虚型较常见，故失眠证候模型研究也以上述类型为主，其他类型关注较少。

文献总结发现，部分中医证候模型的复制只有微观指标，如采用单胺类神经递质作为模型评价指标，缺乏中医四诊合参和病证结合辨证思路[37]，因此在今后模型评定过程中应注意两者相结合。因中药成分复杂，体内药理反应难以控制，因此单一指标升高或降低说服力不高，故在今后中医证候失眠模型复制过程中，应注意症状学与病理生理学相结合[38]。由于大多数模型采用正常动物复制，存在一定可逆性，此类失眠动物模型具有一定的局限性[39]；目前失眠模型报道大多选择啮齿类动物鼠类，但鼠类与人类睡眠时相及周期与人类存在差异，不能很好地模拟临床失眠，因此失眠模型动物的选择是今后急需关注的问题。此外临床失眠由多种因素造成，要使失眠动物模型复制更符合临床实际，复制涵盖多因素的模型是将来失眠模型改进的切入点[40]。中医失眠模型复制是近年来研究者探索较多的内容，因此针对不同失眠证型，研究出科学合理的睡眠剥夺模型还需要深入探索与研究。