狂犬病治疗方法及抗病毒药物应用的研究进展

刘 茜，朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种以侵害中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)为特征的高致死性的人兽共患传染病[1]。目前狂犬病已经在150多个国家被发现，并且每年约有4～7万人死亡。在99%以上的病例中，RABV都是通过家犬传播到人类身上[2]。狂犬病临床症状主要表现为两种：第1种为狂躁型，表现为过度活跃兴奋，并伴有恐水、唾液分泌较多、吞咽困难以及心律不齐等症状，最后以心跳呼吸停止而死亡；第2种为麻痹型，约占病例总数的30%，主要表现为患者的肌肉逐渐麻痹，随后发展为昏迷、死亡。由于第2种类型经常被误诊，导致了狂犬病在流行病学上数据的不完整[3-5]。狂犬病在潜伏期没有任何症状，一旦出现临床症状，其病死率几乎100%，所以，在暴露前或暴露后注射狂犬病疫苗，狂犬病的发病率会大大降低，可以起到有效预防的效果。截止目前，仍然没有有效药物和疗法治疗狂犬病，因此本文对狂犬病治疗相关研究进展进行综述和展望。

1 狂犬病治疗方法

1.1古老的狂犬病治疗方法 历史上关于狂犬病的记载经历了几个世纪，在此期间人类一直同狂犬病做斗争。在公元前1世纪时期，罗马的医生塞利乌斯[6]就对狂犬病的发病过程进行了较详细和精确的记录。他通过观察和试验推测狂犬病的发病可能是由于疯狗分泌唾液中的某些物质传播到被咬伤口上导致的，所以他尝试采用腐蚀瓶、火罐、灼烧和吮吸等方法处理疯狗咬伤的伤口。希腊医生狄奥斯科里迪斯[7-8]尝试过截肢术来治疗狂犬病。到了中世纪前后，一些西方国家的医生开始通过净化、输液、放血疗法及药物来治疗狂犬病[9]。在中国古代，最早记录狂犬病的书籍来自于《左传》，人们那时已经意识到疯狗对人的危害极大，他们通过驱逐疯狗来降低危害。在我国古代相关医书的记载中，人们尝试采用内服和外治的方法来治疗狂犬病。值得一提的是，外治的方法是使用酒来清洗被疯狗咬伤的伤口，这个方法在现代疗法中仍然适用。晋朝的葛洪通过观察狂犬病的发病过程，尝试通过使用咬伤人的狗的脑组织敷在伤口处来阻止狂犬病的发作[10]。现代中国的民间医生也有采用草药或复方中草药来治疗狂犬病，比如采用白芷、天麻等植物外敷，之后使用防风、羌活和紫草等进行内服，尽管出现这样的药方，但是效果都无从考证[11]。在印度，一些农村医生曾在疯狗咬伤的伤口涂上红辣椒来治疗狂犬病[12]。

1.2密尔沃基疗法 密尔沃基疗法是2004年由美国的Wisconsin医学院儿科医院罗德尼副教授创建[13]。当时该儿科医院接收了一名15岁患狂犬病的女孩，此女孩在入院前一个月左右时左手被蝙蝠咬伤，并且前期没有进行暴露后预防(postexposure prophylaxis，PEP)处置，在术前检测时发现该小女孩的血清和脑脊液中存在具有中和性的抗RABV抗体。随后罗德尼医生对小女孩采取以下的治疗方案：首先以氯胺酮进行诱导昏迷，之后给予抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺辅助治疗，最后给予患者镇静剂咪达唑仑和防止脑痉挛的苯巴比妥镇静。通过该方法成功抢救了此女孩，后来这种治疗方法被称为密尔沃基疗法[1]。尽管该小女孩成为此方法治疗成功的第一个案例，但是直到目前为止，关于该小女孩存活的具体原因仍然不明。在随后使用该方法治疗的其他6名发病后幸存的患者中，所有人之前都曾接种过狂犬病疫苗，并在后续观察过程中发现这6名幸存者都存在一些严重的后遗症，甚至出现死亡[14]。自从使用密尔沃基疗法以来，至少有26份类似治疗方法失败的报告，甚至可能还有更多治疗失败的案例没有被报道。其中在该疗法中提到的咪达唑仑、氯胺酮和利巴韦林等药物后来都被证实具有免疫抑制等副作用[15-16]。所以，最新的在线临床治疗中已不建议使用密尔沃基疗法。

1.3狂犬病被动免疫疗法 被动免疫疗法是指通过输入外源免疫效应物质来治疗疾病的一种疗法[17]，目前在狂犬病的被动免疫疗法中应用最广的免疫效应物质是狂犬病免疫球蛋白(Rabies Immunoglobulin，RIG)。但由于RIG大多数来源于动物和人的血液，存在供应不足、成本较高、半衰期短、批次不同影响稳定性等缺点，人们逐渐将焦点放在了单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)上。近年来随着重组单克隆抗体的不断发展及其在肿瘤学领域的广泛应用，单克隆抗体逐渐成为人们解决血液来源RIG局限性的可行且有前途的选择[18]。单克隆抗体具有特异性高，适用于大规模生产并且可以避免血液传播等优点，越来越成为抗病毒治疗上的有效生物制剂[19]。目前已经有5种候选产品的狂犬病病毒的单克隆抗体进入临床试验阶段。研发最先进的产品是Rabishield，它由印度PVT.LTD.血清研究所(SIIPL)生产，经过2期、3期临床试验评估，于2016年在印度获得许可，并于2017年推出[20]。该产品是一个单一的人IgG型单抗，可以结合到RABV糖蛋白的构象表位来中和RABV。此单抗的潜在缺点在于它只含有一种单克隆抗体，无法中和在秘鲁蝙蝠[21-23]中发现的一种罕见的RABV变种。所以，该产品的具体实用性还有待进一步的调查。另外还有Rabimabs和SYN023也作为两种RABV的单克隆抗体进入到临床试验阶段[23]。尽管狂犬病单克隆抗体具有医疗需求和公共卫生益处，但产品要获得批准伦理上仍然充满挑战。

2 潜在抗狂犬病病毒药物

狂犬病的治疗仍然是一个世界难题，人们在不断探索中发现了很多潜在抗RABV药物和靶点[24-25]。与只能用作预防的疫苗相比，抗病毒药物不仅可以用作治疗，并且还具有易保存、易生产以及成本适中的优点。另外，狂犬病的治疗性抗体成本高、不易保存以及审核程序复杂，所以对于RABV自身来说，找到抗RNA病毒药物要比疫苗和治疗性抗体更加简便。

已知对RABV具有抑制活性的主要药物有利巴韦林、金刚烷胺和干扰素IFN-α，也有其他文献报道过的T-705、香豆素和PGG等药物。

2.1利巴韦林 利巴韦林是一种嘌呤类似物和RNA诱变剂，它可以以相同的效率掺入胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸的模板中来诱导突变[26]。利巴韦林是一种广泛的抗病毒剂，目前用于治疗人的HCV[27]、拉沙热病毒[28]和呼吸道合胞病毒[29]感染。有研究表明利巴韦林具有抗RABV感染的体外活性[30-31]，但是在脑内注射利巴韦林后发现其对RABV街毒株感染的小鼠没有功效。著名的密尔沃基疗法中的抗病毒药物就包括利巴韦林[1]，但是由于利巴韦林对于狂犬病患者的治疗缺乏疗效和存在不良反应，致使密尔沃基疗法出现了失败。所以，关于利巴韦林是否可以治疗狂犬病，仍然需要更多的研究和探讨。

2.2干扰素 干扰素尤其是I型干扰素(IFN-α/β)，是抵抗病毒感染的重要防御手段。在包括Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)和细胞质视黄酸诱导基因I(Retinoic acid-induced gene I，RIG-I))识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)之后，它们几乎在所有细胞中产生，并诱导激活级联反应产生I型干扰素。RABV进入神经系统后会触发先天性免疫应答，包括I型干扰素应答。最近的研究表明，这种应答会限制RABV在接种部位的肌肉中传播，并减慢向脊髓的转移从而延缓小鼠的死亡。目前有实验证明用外源性干扰素治疗可防止RABV在细胞培养物中复制，尤其是在感染之前或感染后进行治疗[32]。用外源干扰素或干扰素诱导剂(poly I：C)进行治疗，可以部分或完全抑制小鼠和恒河猴模型中的RABV感染[33]。当在病毒感染之前或之后大剂量使用这种化合物并尽可能靠近病毒接种部位时，疗效更高。

2.3金刚烷胺 金刚烷胺是一种合成的抗病毒药物，也是一种弱的非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)拮抗剂，它可以抑制病毒在细胞中的复制[34]。有两项体外研究评估了金刚烷胺在RABV感染中的作用。其中之一是金刚烷胺可干扰CER细胞中RABV固定株(CVS-11)的复制，其剂量依赖性的抑制作用范围从25 μg/mL抑制10%到250 μg/mL抑制99.9%[35]。当药物与细胞预温育后并在病毒感染前移出时，或在吸附过程中将金刚烷胺添加到病毒中时，金刚烷胺不会抑制病毒复制，这表明病毒的附着和渗透可能不受药物的影响，因此金刚烷胺可能会阻碍病毒的脱壳[36]。

2.4T-705 目前在抑制RNA病毒复制的分子策略中经常将病毒酶(特别是聚合酶)作为抗病毒药物的潜在靶标[37]。在这样的条件下，T-705(favipiravir)作为一种新型的广谱RNA聚合酶抑制剂被人们广泛关注。其显著优势在于它并不干扰细胞中DNA和RNA的合成[38]。有体内和体外实验证据表明这种药物可以抗流感病毒[39]、沙粒病毒[40]等。而Banyard AC等团队也评估了T-705药物的抗RABV作用，发现该药在体外实验中可以有效减少病毒的复制，但是在体内实验中该药在RABV暴露前和暴露后治疗中效果有限[41]。所以，关于T-705抗RABV的具体作用机制，应鼓励研究人员去评估。

2.5香豆素 香豆素(coumarin，CM)是一类重要的含苯并α-吡喃酮结构的芳香氧杂环化合物，其主要存在于植物的根茎叶中，也可以存在于细菌、真菌的代谢物中。根据其官能团的不同，可以分为9种，分别命名为CM-1～9，这些化合物具有多种功能，包括抗肿瘤、抗炎症、抗氧化以及抗病毒等特点。在抗病毒方面，香豆素对HIV、疱疹、肝炎等具有显著的抗病毒作用，并且有些已经进入临床试验阶段[42-44]。而徐梦娴等人已经发现CM-3可以有效抑制RABV在宿主细胞内的复制，但不能直接灭活病毒，不能阻止RABV对宿主细胞的吸附。之后通过动物实验证实CM-3可将感染RABV的小鼠的存活率由0提升到12.5%[45]。因此，关于香豆素化合物是否能成为治疗狂犬病的潜在药物还有待进一步研究。

2.61,2,3,4,6-五没食子酰基葡萄糖(penta-O-galloyl-beta-D-glucose，PGG) PGG属于水解鞣质多酚类化合物，广泛存在各种草药中，如盐肤木属、牡丹属和芍药属。它具有多种生物学活性，包括抗癌、消炎、抗氧化作用，同时它还具有广泛的抗病毒作用[46-47]，涂忠忠等人发现PGG 不仅可以直接灭活RABV、抑制病毒的吸附和侵入，而且可以在病毒感染后抑制病毒基因和蛋白的表达。其中体内实验结果显示 PGG 可缓解感染RABV小鼠的临床症状，并且可降低 27.3%的死亡率[48]。未来需要更多的实验数据来证实它的可靠性。

3 展 望

狂犬病的病死率几乎100%的原因有4点。第一，从RABV传播途径可知它并不像其他病毒那样通过自身强大的复制能力抵御机体的免疫系统或者通过攻击免疫能力下降的宿主来繁殖，它主要是通过免疫豁免的神经系统进行传播和复制，这样不仅为该病毒传播提供了充足的时间，并且也正好逃避了人免疫系统的攻击，因此RABV的嗜神经特性是导致狂犬病致死的主要原因[49]。第二，RABV在感染机体后并不能引起足够的天然免疫反应来反抗病毒，所以狂犬病在潜伏期缺乏明显的症状，阻碍狂犬病早期诊断也成为狂犬病高度致死的原因之一[50]。第三，RABV可以被狂犬病毒抗体中和，但是有效的抗体无法通过血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)进入中枢神经系统，这也是狂犬病致死的一大原因[51]。第四，当前没有有效的用于体内杀灭或抑制RABV的药物。因此，本文也对未来狂犬病治疗方面的研究进行展望。

3.1血脑屏障的突破 RABV抗体可在体外或病毒进入中枢神经系统前高效中和RABV[52]。然而，一旦病毒进入中枢神经系统，这些抗体就被限制通过具有免疫特权的血脑屏障，从而不能中和感染的病毒[53-54]。虽然从理论上讲，这种抗体可以在脑内注射，但它绝对不是一种实用的治疗方法，所以提高血脑屏障的通透性至关重要。已有报道称RABV的弱毒株、细胞因子MCP-1等物质可以增强血脑屏障的通透性使免疫细胞进入中枢神经系统消灭病毒[55]。另外，有人在小鼠实验中通过使用细胞因子MCP-1增强血脑屏障的通透性后，静脉注射病毒中和抗体可以清除中枢神经系统的RABV，并且延长了感染RABV小鼠的生存时间[56]。此研究正好为狂犬病的临床治疗提供了基础，例如可以采用提高血脑屏障通透性的药物或弱毒株等打开血脑屏障，之后通过注射抗体或抗病毒药物中和或杀灭病毒。

3.2神经或免疫细胞相关信号通路 有研究发现在感染RABV实验小鼠的大脑中，神经细胞出现的细胞凋亡相较于免疫细胞并不明显，这种差异是由于RABV通过将其自身基因表达维持在阈值水平以下来干扰促凋亡因子，从而保证了受感染神经元的存活[57]。另外，有研究发现RABV通过线粒体途径诱导细胞凋亡，其途径包括线粒体膜电位的改变、细胞色素C的释放，这些结果提示RABV在不同感染阶段利用线粒体来调节细胞凋亡，从而为病毒复制和传播提供条件[58]。所以未来在治疗狂犬病方面，神经细胞中的线粒体相关信号通路的变化以及免疫细胞的凋亡相关问题可以是进一步研究的方向[59]，通过找到相关靶点来筛选特定药物以达到治疗的目的。

3.3狂犬病病毒G蛋白 有报道称RABV诱导的免疫细胞凋亡依赖于糖蛋白的限制性表达，其中包括G蛋白羧基端PDZ域结合基序的4个氨基酸。G蛋白表达量越低，狂犬病的致病性越强，因此，未来以降低G蛋白的表达为策略寻找相关治疗方法也可以作为治疗狂犬病的一个重要手段[60]。

3.4治疗性疫苗 在狂犬病治疗方面也有一些其他的探索，例如狂犬病的治疗性疫苗，傅振芳团队利用无致病力的5型副流感病毒(PIV5)表达RABV的G蛋白，作为RABV感染的治疗方法。结果发现，PIV5-G可以在RABV感染后的6 d之内保护小鼠。因此该PIV5-G可以用于预防和治疗RABV感染的候选疫苗[61]。未来开展治疗性疫苗与治疗性抗体相结合的方法也是一种治疗狂犬病的策略。

4 总 结

狂犬病当前仍然是没有治愈方案的传染病，人们尝试通过不同方法去治疗，但是疗效甚微，而抗病毒疗法是目前开发有效的人类狂犬病治疗的重要组成部分。开发包括具有广谱活性的T-705等抗病毒药物，尽管会存在不同缺点，但是通过优化使用条件或者联合使用对治疗狂犬病仍然具有重大意义。最后，通过新的靶向方法，包括RABV的G蛋白的表达、线粒体介导的细胞凋亡、神经元的氧化损伤等都是未来可以研究探讨的内容。随着我们对RABV致病机制的进一步深入研究，将会发现更为有效的狂犬病治疗方法。

利益冲突：无