影响荧光定量PCR实验准确性的因素剖析

李世凤

(民乐县畜牧兽医工作站,甘肃 民乐734500)

近年来，尤其是H7N9流感及非洲猪瘟疫情爆发后，荧光定量PCR诊断方法在基层动物疫病防控、检疫检验、流行病学调查和疫病诊断中的优势越来越凸显。PCP方法因其敏感性高、操作简单、诊断周期短、准确性高的特点，已经成为基层畜牧兽医业务部门最主要的诊断手段之一。

如何在最短的时间内做出最准确的判断就显得尤为重要。荧光定量PCR实验必须在二级生物安全水平以上实验室内、由技术过硬的专业人员精准操作下完成。因此，本文从以下3个方面，简单分析影响实验精准性的因素。

1 二级生物安全实验室的运行基本要求

1.1 实验室的选址要求

实验室选址不仅要符合国家、当地的环境保护部门要求，也要复符合建设主管部门的要求。首先要了解这些要求并征得其部门同意和批准，方可进行实质性的设计和建设，不要盲目选址建设。要根据当地四季温差、风向、温度变化范围、空气湿度等自然条件，建在相对地势较高、僻静、交通相对便捷的地方。

1.2 实验室建设要求

选址完成之后，建议请专业的实验室设计人员，根据现有的条件，设施设计和规划建设实验室，充分考虑未来实验室的使用方向和可能的发展趋势。建设原则要符合各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作的原则。硬件设施要求越完善，越有利于运行管理。我县的兽医实验室建在原民乐县畜牧兽医局办公楼一楼，与办公区域独立分开，建设之前就在民乐县环保局的备案。

1.3 建立完善的质量管理和生物安全管理体系

一个合格的兽医实验室必须要有规范的质量管理体系和生物安全管理体系并且严格执行。我县兽医实验室制定了完善的质量手册、生物安全手册、程序文件等，建立了严格的管理体系。

1.4 过硬的人员队伍

兽医实验室管理人员必须要有防范大于治理的安全意识，把好质量安全和生物安全关。技术人员要掌握必要的理论基础、积累一定的实验室工作经验并且掌握荧光定量PCR实验工作原理、熟悉仪器设备、掌握不同试剂原理，最好人员队伍固定。我县兽医实验室现有专职实验室工作人员3名，均在5年以上的实验室工作经历，都具备中级以上职称。

1.5 合格的硬件设施及辅料

荧光定量PCR实验对硬件设施要求高，必备的生物安全柜、离心机、移液器及常用的一些辅助试剂和耗材(采样管、拭子、离心管、PCR管、吸头、移液器、无核酸酶水和试管架等)必须符合基本要求。

民乐县动物疫病预防控制中心兽医实验室在2004年农业部动物防疫基础设施建设项目和2017年兽医实验室能力提升建设项目的基础上，对兽医实验室进行了改扩建。目前建筑面积达458平方米，设有解剖室、接样室、档案室、无菌室、血清学检测室、病原学检测室、分子生物学实验室七个功能室。2020年5月通过甘肃省兽医局的授权，开展非洲猪瘟荧光PCR检测，止目前共检测34批次2691份样品，涵括血清、环境样品、生猪运输车辆及组织等。样品覆盖全县的规模养猪场(户)、生猪定点屠宰厂、辆运输车辆。同时开展口蹄疫病毒及H5、H7流感病毒的检测，累计完成3469份样品的分子生物学检测实验。

2 样品的采集、处理、保存和运输

实验样品采集遵循适时、合理、典型、无菌、安全的原则。采集样品时要根据不同的疾病或者检验目的，采集相应的脏器、内容物、分泌物、排泄物等，样品要有代表性；同时做好自我安全防护，以免造成不必要的损伤。采样结束后做好包装、运送和记录工作。并在最短的时间内送检。

样品的采集、处理、保存和运送时检验工作顺利开展的基础，样品决定了实验结果的可靠性。所以说样品的采集、处理、保存和运送是十分重要的。具体采样要求建议参考原农业部2002年8月颁布的“动物疫病实验室检验采样方法(NY/T541-2002)”。

3 人为因素

对于基层兽医检测人员来说，在实验室已经建设好、现有的硬件设施及实验室的辅料，影响实验结果准确性最主要因素的是实验过程的各种人为因素。笔者从事多年的基层兽医实验室工作，认为在现有的条件下，以下几个方面是提高实验准确性的关键环节。

3.1 实验准备工作

实验前的准备工作十分重要，但往往却经常被忽视。首先要根据委托协议查看实验目的，准备耗材、提前开启仪器设备保证正常运行、所需试剂回温及耗材查漏补缺等必备工作。其次检查待检样品是否符合实验要求，如符合须先处理样品(包括置盲、留样及灭活、稀释等前期工作)，实验前样品处理(样品灭活)可避免污染实验室的现象发生，留样是复检的前提。

3.1.1 确定耗材及以前配件是否使用正确 耗材对于荧光定量PCR来说比较重要，很多异常扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的有错误使用普通PCR仪器所对应的耗材，透光性太差，可能会出现打折的曲线。没有选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材。造成反应管外壁与荧光定量PCR仪器温控模块没有充分接触，热传导不充分进而影响酶的活性，出现假阴性的结果。使用质量差的耗材可能出现荧光值不稳定得到的CT值不稳定。

3.1.2 确认所有试剂是否正确 确认试剂是否有效，核查有效期、运输条件、是否反复冻融等。若以上任何一项不符合，建议废弃不用以免影响实验准确性。

3.2 实验过程

实验过程简单的说就是按照试剂说明书完成核酸提取、体系配制、扩增分析三个过程。其中最关键的环节核酸提取、体系配置。整个过程需要在独立的区域内(即准备区、配置区、扩增分析区)、按照单向移动(洁区到污区)的原则完成。

这个阶段要求实验室工作人员手稳、手快、心细。我认为荧光定量PCR实验的以下操作细节要特别注意：

3.2.1 从冰箱冷冻取出的试剂是否混合均匀 提取核酸加样是否精准、倒废液的时候是否污染了手套及操作台面、离心管盖是否盖严实、离心过程进来避免甩开管盖等。

3.2.2 扩增之前加样是否精确 有没有挂在八连管管壁、八连管盖密闭性检查、八连管与PCR仪有没有充分接触、八连管内有没有气泡等等。

3.2.3 确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书，检车时间、温度、循环数、荧光采集等设置是否正确。

如果以上都正常，一般来说不会出现异常的扩增曲线。但是个别情况下还是会出现，这就要求实验室工作人员具备判断数据结构的能力，为什么会出现异常曲线以及怎么避免出现异常曲线。

3.3 实验室去污染和废弃物处理

实验结束后对样本、设备、操作台面及操作间等进行清洁、消毒、灭菌是最后环节。结合本人工作实际，PCR实验废弃物经过高压灭菌之后，交于医疗废弃物处理机构统一处理。操作台面、生物安全柜、移液器、试管架等硬件设施通过84消毒液喷洒--核酸去除剂喷洒--酒精擦拭三步法，辅以紫外灯照射彻底消毒。为下次实验做准备。

综上所诉，在实验室建设运行情况良好的情况下，符合样品符合检测要求、技术过硬的工作人员三个必备条件下，注意操作细节，选用合适的耗材及辅料，严谨细致的工作态度，才能克服影响因素从而大大提高实验准确性，为快速准确的判断疫情、检疫检验结果提供判断依据。