表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究

高应瑞，刘珂飞

（天津生机集团股份有限公司 300384）

1 包涵体蛋白溶解

尿素，盐酸胍和强离子洗涤剂如N-月桂酰肌氨酸是最常用的溶解剂。在变性剂溶液中溶解包涵体可能是一种已经很明确的方法，但是可能聚合可溶性低聚物。鲜为人知的是，在变性溶液中可能会形成聚合物。在变性剂溶液中，由于离子变性的作用，在蛋白复合物之间产生强大的静电斥力，进而将包涵体分散为单分子结构[1]。

通常情况下，浓度为6～8M的尿素和6～7M的盐酸胍可以实现蛋白质的溶解。然而，即使在浓度最高的情况下，蛋白质分子内和分子间发生的相互作用往往也可导致非天然结构的形成，在变性剂含量降为中等浓度时，其（尿素和盐酸胍）与蛋白质的结合力也降低，因此，蛋白质分子开始重新折叠。因此，它有可能通过调节盐酸胍和尿素的浓度来调节其与蛋白的结合力，以至于使复性过程更加有效。这种情况不包括洗涤剂在内。洗涤剂与蛋白的结合力决定于其临界胶团浓度(CMC)的大小。这种胶团结合往往在临界胶团浓度之上，即变性非折叠蛋白溶解性好的条件下发生，而这种胶团结合不能或者很少能在临界胶团浓度之下，即蛋白溶解性差的条件下发生[2]。

这表明，只有在洗涤剂存在的条件下，蛋白复性过程才能发生，否则，去除洗涤剂后，蛋白质结构和溶解度又将形成原包涵体。

2 蛋白复性

复性过程是蛋白质构象从展开状态到折叠状态的变化过程。包涵体只能由强变性剂溶解，使其蛋白质呈展开状态，其溶解程度主要取决于蛋白质本身及其所使用的变性剂类型。包涵体经过变性剂溶解后的蛋白质为高度可溶性。与纯化的蛋白复性研究不同，包涵体溶解蛋白含有蛋白表达系统产生的杂质，其可能干扰蛋白质的复性。因此，为了减少杂质对复性过程的干扰，可以先对该蛋白质进行纯化。

以下，我们分别描述了这两个参数，但在复性过程中，应结合这两个参数寻求最佳优化条件。首先，我们讨论减少变性浓度的各种方式。

2.1 分步透析复性

该透析方法来降低变性剂浓度已成功应用于抗体蛋白的复性[3，4]。首先将展开蛋白样品置于高浓度变性剂溶液中，然后置于中等浓度的变性剂缓冲液中，最后置于低浓度变性剂缓冲液中。其与一步透析的区别在于每个变性剂浓度平衡的建立。然而，如果错误折叠或聚集率(kmis/agg)高于复性速率（kref）。那么这种方法将不起作用。

2.2 递减变性剂浓度透析

为变性剂浓度递减的一步透析法[5]。在高浓度变性剂中的变性蛋白装入透析袋后置于变性剂溶液中，将透析液逐渐抽出，同时逐渐抽入复性缓冲液，透析过程中溶剂的泵出速率和复性液的泵入速率决定了变性剂浓度梯度减少。如果速度太快，它将类似于一步透析法，如果速度缓慢，它又类似于多步透析法。

2.3 凝胶过滤交换法

凝胶过滤柱在复性缓冲液中平衡。在变性液中的展开的蛋白质上柱，用复性缓冲液进行洗脱。使用脱盐柱将使蛋白质与变性剂分离，而使用按蛋白质大小分离柱将分离得到不同片段大小的蛋白质。在一次透析复性过程中，变性剂浓度逐渐递减，同样，在凝胶过滤法中变性剂浓度也逐渐减少。如果展开结构或中间折叠结构转换为天然结构的速率慢于转换为错误折叠或聚集体的速率，那么随着变性剂浓度的逐渐降低错误折叠构象将没有足够的时间转换为天然结构。另外，长时间暴露在中间变性浓度可能会导致蛋白质聚集或错误折叠。与透析的区别在于在其蛋白在折叠过程中柱模型所处的环境不同。在能够防止蛋白错误折叠与聚集的中间变性剂浓度下的蛋白折叠过程中，凝胶柱可能通过氢键和疏水作用与蛋白相互作用。而且柱模型可以使蛋白分散，有效减少了蛋白聚集。该方法已经成功应用于盐酸胍溶解的人白介素-6(IL-6)的复性[6]。

2.4 稀释

高变性剂浓度蛋白质样品加入到大量的复性缓冲液中。稀释法没有经过中间变性剂浓度，因此展开蛋白在稀释过程中会迅速崩溃。所以，在稀释复性过程中有几个参数需要考虑。首先，在正常稀释法中，将在变性剂中的展开蛋白加入到复性液中时，蛋白质浓度与变性剂浓度都在增加，例如将6M盐酸胍溶解的蛋白质溶液加入到复性缓冲液中稀释6倍后，复性缓冲液盐酸胍浓度从0M变为1M。如果没有低浓度变性剂浓度的存在，稀释至缓冲溶液后将迅速崩溃形成一些刚性结构，而不再能进行结构的转变以及不能转换为天然结构。因此，我们建议在最终应该含有一定浓度的变性剂，浓度的大小主要取决于蛋白复性后的稳定性。

2.5 反稀释

反向稀释是将复性缓冲液加入到含有一定浓度变性剂的展开蛋白质溶液中，该情况下无论是变性剂和蛋白的浓度，都同时降低。与稀释法不同，在中间浓度变性剂中蛋白质浓度较高。这样的条件下会导致蛋白的聚集和沉淀。然而，如果在中间的变性剂浓度的条件下，中间结构为可溶和复性需要缓慢的结构重排，这个方法可能比较适用。

2.6 固相复性

在变性剂存在的情况下，变性蛋白首先与固体基质（如镍树脂或离子交换树脂）以非共价结合。然后变性剂浓度减少为初始复性液浓度。由于蛋白质分子与树脂结合，该过程中减少了展开蛋白的聚集和折叠中间体的形成。

2.7 小分子物质助溶

小分子物质（溶质）通常被添加到复性溶剂中，以协助蛋白折叠。在一般情况下，特别是通过稀释复性，复性溶剂中均含有低浓度的尿素或盐酸胍。这个浓度是足够低，以能保持高效复性，但高到足以维持折叠中间体的溶解度和灵活性。然而，仅有尿素或盐酸胍是不够的，共同的溶质往往是必不可少的。没有该小分子的存在，复性会产生不同程度的聚合或错误折叠。这种小分子物质可分为两种，一种为增强折叠，另一种为抑制聚集。

折叠和聚集这两种作用可能具有相互的排斥性，因为折叠的增强原则上增强了蛋白质之间的相互作用，而聚集的抑制则降低了蛋白之间的的相互作用。聚集的抑制减少了折叠中间体的结合而不影响复性过程的进行。它包括聚乙二醇[6]，环糊精[7]，精氨酸盐酸[8，9]，脯氨酸[10-11]。与聚乙二醇和环糊精结合的折叠中间体为疏水区域。在这些小分子物质中，精氨酸盐酸是最常用的。然而，目前尚不清楚，精氨酸盐酸如何降低折叠中间体的聚集。但它对蛋白质稳定性的影响已经很明确，精氨酸盐酸是一种蛋白质稳定，也不折叠增强。精氨酸盐酸既不是一种蛋白质稳定剂，也不增强蛋白的折叠。有许多极性小分子添加剂，提高蛋白质的稳定性[12-13]，并能在体内增强蛋白质的折叠[14]。这些包括糖，多元醇，某些盐类，如硫酸铵和氯化镁，和某些氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。虽然这将提高蛋白质折叠成一个紧凑的结构，他们也可增强错误折叠和聚合。这些倒塌的结构可能是过于紧凑和刚性，无法使错误折叠的结构重新折叠为天然结构。