“免疫胶体金技术检测牛初乳免疫球蛋白方法建立”项目方案

王明利，周珍辉，张 浩

（北京农业职业学院畜牧兽医系 102442）

1 项目研究背景、目的与意义

初生犊牛的主动免疫系统尚未成熟，处在发育阶段，同时，由于牛胎盘结构的特殊性结构，母源性抗体难以通过胎盘屏障进入胎儿血液循环系统，导致犊牛出生前没有获得被动免疫能力[1]，因此，刚出生的犊牛对外界任何病原微生物的抵抗力几乎是零抵抗。初乳，即奶牛分娩后第一次挤出的乳，含有丰富的免疫球蛋白，也就是母源性抗体，初乳中含有如胰岛素等生物活性物质、激素及生长因子[2]，是初生犊牛在产后2个月健康成长、建立被动免疫系统唯一物质。犊牛出生后对免疫球蛋白的吸收与时间关系密切相联，最初几个小时免疫球蛋白的吸收率最高，平均为30%，而随着时间的延长免疫球蛋白的吸收率急剧下降，尤其出生24h后无法吸收完整的免疫球蛋白抗体。如果犊牛出生24h饲喂初乳，那么将导致50%以上的犊牛因缺乏免疫力而难以成活[3]。充足高质量初乳可以帮助新生犊牛尽快建立起被动免疫系统，从而提高成活率、增加日体重。免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术[4]。

免疫胶体金技术随着医学的发展而快速发展，免疫胶体金技术具有操作简单、快速出结果且结果易于判定、特异性好、不需要任何复杂的仪器、适用现场操作等特点，所以广泛地应用在兽医临床诊断中，本研究旨在建立免疫胶体金技术检测初乳中免疫球蛋白含量的快速测定方法，并在奶牛生产中推广应用。

2 主要研究内容及预期目标

2.1 主要研究内容

2.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备及抗体的纯化

试验兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备包括兔的免疫及血清分离；抗体纯化包括DEAE-纤维素的活化、装柱、加样、洗脱和测定[4]。

2.1.2 免疫胶体金技术检测初乳免疫球蛋白方法的推广应用

将通过上述步骤建立的免疫胶体金测定初乳免疫球蛋白方法在奶牛场推广应用，进一步摸索应用条件和检测条件，并制定相关的技术标准。

2.2 免疫胶体金检测牛初乳免疫球蛋白含量方法的建立

2.2.1 胶体金颗粒制备采用柠檬酸三钠还原法 用超纯水把1%氯金酸溶液稀释100倍，浓度为0.01%，用微量移液器吸取0.01%氯金酸溶液50mL于三角瓶，置于电热板煮沸，准确量取一定量1%柠檬酸三钠溶液加入三角瓶中，轻轻摇匀继续煮沸，直至氯金酸溶液由蓝色变成红色，继续加热4min[5]。冷却至室温加超纯水至原体积，无菌密封保存。在电镜下观察，如果颗粒大小均匀、近似圆形，说明制作的胶体金颗粒合格，通过调节l%柠檬酸三钠的用量，实现直径为2Onm的胶体金制备。

2.2.2 胶体金标记标准牛免疫球蛋白的制备 通过试管法确定蛋白最小标记量以及胶体金标记蛋白最适宜的pH值[6]。将标准牛免疫球蛋白溶液加入胶体金溶液中，加入终浓度的牛血清白蛋白。采用超速低温离心法纯化金标蛋白[7]。

2.2.3 检测膜片的制备 用包被缓冲液把兔抗牛免疫球蛋白稀释成6种不同浓度，在每个硝酸纤维素膜片上选择6个不同的点，每个点滴10μL，室温阴干，在封闭液中封闭2h，再用PBS洗涤2次[8]，室温阴干，4℃保存备用。将包被好的硝酸纤维素膜与金标蛋白反应，观察硝酸纤维素膜上点的颜色，确定硝酸纤维素膜膜上抗体最佳包被浓度[9]。

2.2.4 标准参照物的制备 将检测膜片分别与不同浓度的标准牛免疫球蛋白反应洗涤。取出用滤纸吸干，再与金标标准牛免疫球蛋白反应5min后洗涤[10]。观察与不同浓度的标准牛免疫球蛋白反应的硝酸纤维素膜膜上红色点的个数及颜色深浅变化，作为标准参照样以判定待检样品的浓度[9]。

2.2.5 样品的检测 将牛初乳样品离心，取中间层，将乳清适当稀释与检测膜片反应。取出膜片洗涤，再与金标蛋白反应，与标准参照物对比[11]，确定待测样品的浓度。

2.3 预期目标

本研究采用免疫胶体金技术测定牛初乳免疫球蛋白，通过试验建立起免疫胶体金半定量检测牛初乳以及乳制品中免疫球蛋白含量的方法，实现现场、快速、简便易行的牛场初乳免疫球蛋白含量测定。

3 研究方法、技术路线及实施方案

3.1 兔抗牛lgG抗血清的制备及抗体的纯化

3.1.1 兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备

第一次免疫用弗氏完全佐剂抗原，在兔子皮下选没有重复的6个点进行注射，3周后进行第二次注射，选择弗氏不完全佐剂抗原注射，第4周进行第3次注射，7d后采兔子耳静脉血，测定血清效价，当效价达1∶16的效果，可以进行心脏采血，分离血清，-20℃冻存[12]。

3.1.2 抗体纯化

取1O deae-纤维素浸泡在1000 mL蒸馏水中搅匀，静置、取细颗粒，用1000mL氢氧化钠溶液洗涤大约1h，再用蒸馏水冲洗至pH值接近7，做为缓冲液备用，采用重力沉降的原理装柱子，柱子选用直径2cm，长20cm的玻璃柱。血清用洗脱缓冲液透析，微孔膜过滤，4℃离心，加样，洗脱，测定获取的蛋白的纯度[13]。

3.2 免疫胶体金技术检测初乳免疫球蛋白方法的推广应用

将通过上述步骤建立的免疫胶体金测定初乳免疫球蛋白方法在奶牛场推广应用，进一步摸索应用条件和检测条件，并制定相关的技术标准。

4 重点、难点和创新之处

本研究将免疫胶体金技术引入定量测定牛初乳免疫球蛋白，通过试验建立起免疫胶体金半定量检测牛初乳及制品中免疫球蛋白含量的方法，实现适合牛场现场、快速、简便易行的牛场初乳免疫球蛋白含量测定。重点在于兔抗牛免疫球蛋白的制备和纯化、胶体金标记蛋白最适标记量和最适PH值的确定、检测膜片与金标蛋白最佳反应时间的确定等。

5 实现本项目预期目标已具备的条件

作者近年来主要从事动物性食品卫生检验的教学与研究工作，在奶牛营养代谢病的防治和犊牛健康保健技术方面做了较为广泛的研究，对奶牛营养，特别是犊牛饲养管理方面的营养管理方面积累了丰富的经验。

项目的实施依托“现代农业产业体系北京市奶牛创新团队农职院综合试验站”和北京市奶牛产业科技资源站。近年来，项目团队已承担并完成多项项目研发与技术推广工作。以北京农职院为第一完成单位奶牛健康养殖技术创新与集成推广”项目荣获2013年度北京市农业技术推广奖三等奖。项目的“团队成员学历层次高，学术背景好，研发能力强，专业涉及临床兽医、动物营养等方面，完全有能力承担并完成该项研究任务。项目申请单位已建立起专业化的“牛病诊治实验室”平台，有Bio-Rad酶标仪、全自动生化检测仪、全自动乳成分分析仪等设备。因此，本项目的实施具备了必须的仪器设备和试验条件。