新型兔出血症病毒与经典型病毒的差异

（长宁县动物疫病预防控制中心，四川长宁 644300）

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由杯状病毒科兔病毒属的兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一类具有高度传染性及急性致死性的烈性传染病，被称为养兔业头号杀手，民间称为兔瘟。1984 年我国在江苏省用于商业配种的德国源安哥拉兔上首次发现RHD。RHD 以全身实质器官高度败血性为主要特征，死亡率可达100%，并于20 世纪末，在欧洲、非洲、亚洲等多个国家和地区暴发，给全球养兔业带来巨大冲击。2010 年，法国一家已免疫了RHD 疫苗的兔场暴发了非典型RHD，并从中分离得到一株新毒株[1]。该新毒株的基因序列及抗原性与经典株有较大差异，两者之间交叉免疫较弱，被命名为RHDV2（或RHDVb）。随后该病毒在西班牙、英国（苏格兰）、意大利、澳大利亚等欧洲国家广泛传播，有替代经典毒株的趋势[2]。2020年4 月，我国四川省两个家兔养殖场同时出现非典型症状的RHD。经病原基因序列分析发现，引发疫情的病原与2010 年法国分离的RHDV2 处于同一进化分支，最终诊断为我国首例新型RHD，并首次分离到RHDV2 毒株SC2020[3]。新型RHD 也具有较高发病率和致死率，且现有疫苗不能提供完全免疫保护，一旦发病严重危害养兔业发展。因此，有必要了解新型与经典型RHDV 病原学、流行病学以及诊断与防控方面的差异。

1 病原学特征

与杯状病毒科其他属成员相比，兔病毒属病毒是基因组较小的未折叠单链RNA 病毒，病毒颗粒为包含有32 个杯状凹陷的20 面体对称结构，大小为35～40 nm，包含有编码衣壳蛋白VP1 和一些非结构蛋白的ORF1 以及编码VP2 的ORF2。

目前不同时间段分离得到的经典RHDV 毒株之间基因差异较小[4]，根据其衣壳蛋白（VP60）差异，共分为G1 至G6 共6 个基因型，并具有明显的流行时段性，其中G6 型为抗原变异株，又称为RHDVa，是当前的主要流行毒株[5]。

遗传进化分析[6]显示，RHDV2 与经典RHDV亲缘关系较远（基因同源性为82.4%），且两者的抗原表位存在明显差异，大多数抗经典RHDV单克隆抗体不能与RHDV2 抗原结合，在临床症状及抗原性上，RHDV2 更靠近以欧洲褐色兔为宿主的欧洲褐色兔综合征（European brown hare syndrome，EBHS）。有专家猜测，RHDV2 是由杯状病毒兔病毒属的其他病毒发生物种跳跃传播到兔引起的，而非RHDV 进化而来，两者在易感动物、临床症状、病原特性上均有差异，属于不同的病毒分支[7]。

在易感动物上，经典RHDV 主要感染成年家兔，对6～8 周龄兔感染性较低，对4 周龄以下的幼龄家兔不具备感染性；而RHDV2 可感染幼龄和成年家兔及欧洲野兔的Cape hares 品种，是该属唯一一个可跨物种传播的病毒，表现为对不同品种和年龄兔均易感。流行病学研究[7]发现，在2010 年10 月首例RHDV2 感染发现前，该病在同年4 月就已在法国其他兔场和野外发生，随后迅速在法国及相邻国家传播，造成大量野生兔群和养殖场兔群发病死亡[6]。Fouchet 等[8]2008 年建立的数据模型表明，中等毒力的RHD 样病毒（如RHDV2）在群体较为分散的野生兔子群体中致病性更高。仔兔对RHDV2 的高易感性，极大加剧了该病在兔群内的传播。研究[9-10]表明，RHDV2 不同毒株间的毒力存在明显差异。经典RHDV 可通过口腔、鼻腔、结膜和肠道传播，也有通过食血昆虫、带毒鸟类传播的相关报道。自然感染门户主要是消化道和呼吸道，优先通过粪便传播，也可经排泄物、分泌物或污染的饲料、饮水、笼子、设备等传播[11]。研究[12]发现，持续排毒的病兔是经典RHDV 的主要传染源，病毒粒子可在其血液、器官、皮肤甚至毛发中检出，暴露在自然条件下的病兔尸体带毒时间可长达3 个月。而RHDV2 在骨髓内检出[10]也证明了尸体可长时间持续带毒，因此可作为流行病学追溯的采样选择。

2 引发的临床症状及病理变化

在发病表现上，经典RHD 常表现为急性症状，在流行初期常见无症状突然抽搐死亡，死亡率可达80%～100%，仅有5%～10%的病兔可表现为亚急性或慢性发病（以明显肝损伤和脾大为特征），耐过病兔体内可产生有效免疫应答，抗体水平较高可抵抗二次感染[13]。新型RHD 病症以亚急性和慢性病症为主，死亡率为50%～70%，部分急性病例死亡率较高，一般在发病3～4 d 内死亡，部分感染动物可无任何临床症状并可正常饲养（经血清学检测，发现产生抗体）[7]。新型RHD 伴有特别的皮下黄疸，肝脏大，呈灰白，以及脾脏大、小肠局灶性坏死等症状[7]，表现为EBHS 相似性。动物攻毒试验[7]发现：与经典RHDV 相比，RHDV2感染病例病程持续时间更久。研究[13]发现：经典RHDV 感染动物1 h 后可首先在肝脏检出大量病毒复制，36～48 h 发病率达到顶峰，72～96 h 后大部分死亡。采取病死动物肝脏样本，经血凝试验检测，在相同操作条件下，发现RHDV2 与经典RHDV血凝效价相似[6]，说明两种病毒致死动物的肝脏内病毒含量相似。

3 致病机理

目前RHDV2 与经典RHDV 都不能进行体外细胞培养，因此关于其致病机理研究较少，主要以动物试验为主。现已知杯状病毒主要通过富含组织血型抗原（HBGA）受体的呼吸道和消化道上皮组织进入宿主体内。RHDV2 与经典RHDV 基因序列相比较，有几个衣壳序列区域出现了遗传变异，表现为一定的抗原差异性，这可能是造成两者对Cape hares 敏感性差异的原因。也可能表现为，在进入途径中与HBGA 的特异性结合差异[7，14]。经典RHDV 首先攻击肝脏组织[12]，大量增殖后经血液循环进入肺脏、脾脏（特别是红髓部分）等实质器官，造成全身弥散性血管内凝血（DIC，是主要致死原因）。目前经典RHDV 对4 周龄以下幼兔不易感染的原理尚不清晰。有研究[15]发现，经典RHDV 感染后只有少量病原能在肝脏细胞中被检出，其他器官不能检出或量低，猜想可能与仔兔肝脏中病毒组装或传递受阻相关，也可能与仔兔自身病毒清理能力相关。Aleksija[10]等对成年和幼龄家兔进行了RHDV2（澳大利亚毒株）攻毒试验，结果表明与经典RHDV 一样，RHDV2 最先攻击肝脏并以肝脏病变最为明显，不同的是幼兔表现出急性肾炎；随后在不同年龄段的兔体肝脏、脾脏、骨髓、血清中检测到大量抗原，肾脏体内抗原检出仅在未成年兔体内，在淋巴及肺脏等微弱病变组织中未检出病毒。该研究还发现，RHDV2 在幼龄及成年兔体内均引起巨噬细胞、单核粒细胞等增多的嗜异性反应，与经典RHDV 入侵幼龄兔肝脏细胞引起的淋巴细胞增多不同（被认为是机体清除病原的方式），这可能与RHDV2 可在幼体兔肝脏细胞内复制有关，被认为是两者易感动物差异的主要原因。

4 检测与疫苗研发

两种病毒都能与人类O型血红细胞产生凝集，因此可参照我国农业行业标准《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法》（NY/T 572—2016）对疑似病例进行初步筛选。但该法极易出现假阳性和假阴性，不可作为确诊依据。目前已有关于经典RHDV 的RT-PCR、巢式PCR、ELISA、荧光定量PCR、胶体金检测卡等检测手段的报道[16]，但这些方法能否用于RHDV2 检测还待进一步确认。目前江苏省农业科学院对我国首株RHDV2 的VP60基因进行了扩增和测序[3]，并建立起两者的RTPCR 鉴定方法[17]，可用于实验室区分鉴定。

目前注射疫苗是防控该病的最有效手段。已有多种针对经典RHDV 的商品疫苗，也有相关DNA 基因疫苗报道[18]。受研究进度所限，RHDV2商品疫苗研究相对滞后，但各国研究人员都在加快研发进程。Montbrau 等[19]2016 年报道了关于RHDV2 灭活疫苗ERAVAC 的安全有效性。德国科学家Schinkthe[20]等2019 年报道了基于杆状病毒重组载体RHDV2-VP1 疫苗。该疫苗能同时产生较强的体液免疫和细胞免疫，在免疫后7 d 可检测出体内抗体并于14 d 达到有效免疫效价。我国已有RHDV2 单克隆抗体相关制备的研究[21]，并成功构建了RHDV2 与经典RHDV 的病毒样颗粒[22]。这为后续研究提供了基础，但关于我国本土毒株SC2020 的研究仍需加快。

5 结语

新型RHD 已在多个国家和地区暴发，其控制难度和危害远高于经典RHD，一旦发生疫情将迅速在群体内传播，且定殖后清除难度较大，从而对肉兔、兔毛、宠物兔产业造成巨大冲击。我国已有新型RHDV 的相关报道，因其与经典RHDV 之间免疫交叉性较弱，免疫预防上存在较大空白，所以下一步应针对本土毒株加大结构功能研究，加快疫苗开发，做好可疑病例处置和流行病学研究，及时掌握我国疫情状态。目前人类对杯状病毒的认识尚不清晰，缺乏有效的小动物和细胞培养模型，因此通过不同宿主来源的病毒研究，有利于丰富和了解杯状病毒的致病机制。目前RHD 已被科学家提议作为人类急性暴发性肝病的疾病模型[23]，通过对RHD 中细胞死亡机制的持续研究，可能为不同物种中更广泛的肝病发病机制研究提供参考。