EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 甲基化与胃癌癌前疾病的关系

2021-03-28孙良旭彭利军郭安兵张艳青吉布席

中国医药导报 2021年5期

孙良旭彭利军郭安兵张艳青鲁临吉布席

1.山东第一医科大学研究生部山东省医学科学院，山东济南 250062；2.山东省临沂市人民医院消化内科，山东临沂 276000

胃癌是源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，胃癌的发病率、死亡率均位于世界癌症发病率和死亡率前列[1]。东亚地区尤以我国更是胃癌高发地区[2-3]，其早发现、早诊断具有重要意义[4]。近年来关于DNA 甲基化在胃癌发病与预警方面的研究成为热点[5-8]。Asada 等[9-10]研究显示，胃组织EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平与异时性胃癌发生风险相关，但这些基因与胃癌癌前疾病的临床及病理特征之间的关系尚未充分研究。本研究旨在通过对胃癌及其癌前疾病组织行EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平检测，探究其基因甲基化与慢性胃炎萎缩、肠化、癌变等内镜及病理特征的相关性，进一步探讨DNA 甲基化在胃癌早诊早治中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年6 月—2020 年2 月于山东省临沂市人民医院（以下简称“我院”）内镜中心行胃镜及病理检查的192 例患者作为研究对象。纳入标准：①经我院医学伦理委员会批准；②患者许可并签署知情同意书；③符合慢性胃炎、胃癌诊断标准[3,11]。排除标准：①合并其他良、恶性肿瘤及严重基础疾病；②曾行胃部切除手术；③使用对研究造成影响的药物，如甲基化抑制剂等。

依据胃癌的发展模式（Correa 级联），将患者分为慢性非萎缩性胃炎组（95 例）、慢性萎缩性胃炎组（86 例）和胃癌组（11 例）；其中慢性非萎缩性胃炎组男61 例，女34 例；年龄27～81 岁，平均（57±11）岁。慢性萎缩性胃炎组男63 例，女23 例；年龄29～83 岁，平均（61±10）岁。胃癌组男7 例，女4 例；年龄37～87 岁，平均（64±14）岁。三组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 疾病诊断标准

慢性胃炎：符合《中国慢性胃炎共识意见》（2017 年，上海）[11]。胃癌：符合《胃癌诊疗规范》（2018 年版）[3]。萎缩、肠化：符合《慢性胃炎及上皮性肿瘤胃黏膜活检病理诊断共识》[12]。

依据慢性胃炎不同萎缩程度（病理）分为低萎缩组（无、轻度，104 例）、高萎缩组（中、重度，77 例）；依据慢性萎缩性胃炎肠化程度分为低度肠化组（无、轻度，31 例）、高度肠化组（中、重度，55 例）；根据内镜下慢性萎缩性胃炎木村-竹本分类[13]分为低度萎缩组（C1，局限胃窦，24 例）、中度萎缩组（C2、C3，过胃窦、未达贲门，48 例）、高度萎缩组（O1、O2、O3，已达贲门，14 例）。

1.3 方法

1.3.1 标本收集与队列完善标本收集，胃镜诊疗（电子胃镜GIF-H260、H290，OLYMPUS）、病理诊断（10%福尔马林固定）及甲基化测定（液氮、-80℃冰箱存放）规范进行。

1.3.2 基因甲基化测定对胃组织EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因启动子CPG 岛区域相关位点（基因组位置国际编码72920408～72920771、63178334～63178525、84496817～84497022）甲基化水平进行测定。通过多重PCR 技术扩增目的片段，结合二代测序平台，对PCR产物进行测序，检测目标区域甲基化状态，计算不同位点甲基化水平（百分比）。实验流程：DNA 提取[DNA提取试剂盒（Tiangen，上海松茸生物科技有限公司）]，重点在DNA 纯度。亚硫酸盐处理[重亚硫酸盐转化试剂盒（DP215，凯杰生物有限公司）]。目标区域引物设计：EMX （上游：5’-GGAAATTCGTTGGGTATTGAAGG-3’、下游：5’-GACCTTCGAAATCCTAAACGATTC-3’）；miR-124a-3（上游：5’-GAAAGGGGAGAAGTGTGGG-3’、下游：5’-AAATCAAAATCCGCTATAAACACG-3’）；NKX6-1（上游：5’-GGGAAGTGAGTGTATTTGTATGTAC-3’，下游：5’-ACTCCACGATATCCCCAAATATAC-3’）。甲基化位点PCR 捕获[多重PCR 扩增，特异性工作液对质控品PCR 检测，产物电泳检测（3%琼脂糖凝胶）]，样本添加Index，上机测序（Illumina X-10 测序（Read1 测序、杂交Index 引物、Index 测序，Paired End Turnround、合成Read1 互补链，杂交Read2 引物、Read2 测序）等[PCR 仪（A-100、杭州朗基仪器公司），电泳仪（JY600+、北京君意东方电泳公司）。PCR 引物（PAGE 纯化、上海百力格公司），dNTP（promega、上海有渔生物工程公司）]。由上海翼和应用生物技术有限公司支持。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，不符合正态分布的改用中位数（M）[四分位数（P25，P75）]表示表示，多组间比较用Kruskal-Wallis H 检验分析，两组间比较用Mann-Whitney U 检验分析，有显著性差异的两两比较用Bonferroni 法分析；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组、胃癌组不同位点甲基化水平比较

三组EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位点甲基化水平比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。慢性萎缩性胃炎组EMX1 基因（72920455、72920466、72920469）与miR-124a-3 基因（63178433、63178444、63178452）位点甲基化水平高于慢性非萎缩性胃炎组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。胃癌组NKX6-1 基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位点甲基化水平低于慢性非萎缩性胃炎组及慢性萎缩性胃炎组；慢性萎缩性胃炎组NKX6-1基因（84496988、84496933、84496882、84496840）位点甲基化水平高于慢性非萎缩性胃炎组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

2.2 慢性胃炎不同萎缩程度（病理）组甲基化水平比较

高萎缩组EMX1 基因（72920466、72920469、7292 0484），miR-124a-3 基因（63178433、63178452、63178 485）与NKX6-1 基因（84497016、84496979、84496975）位点甲基化水平高于低萎缩组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表2。

2.3 慢性萎缩性胃炎不同肠化程度组甲基化水平比较

高度肠化组EMX1 基因（72920455、72920466、72920469），miR-124a-3 基因（63178334、63178377、63178433）与NKX6-1 基因（84497016、84496979、844 96975）位点甲基化水平高于低度肠化组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表3。

表1 慢性非萎缩性胃炎组、慢性萎缩性胃炎组、胃癌组不同位点甲基化水平比较[M（P25，P75）]

表2 慢性胃炎不同萎缩程度（病理）组甲基化水平比较[M（P25，P75）]

表3 慢性萎缩性胃炎不同肠化程度组甲基化水平比较[M（P25，P75）]

2.4 慢性萎缩性胃炎不同萎缩程度（内镜）组甲基化水平比较

慢性萎缩性胃炎不同萎缩程度（内镜）组EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因不同位点甲基化水平比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。高度萎缩组EMX1 基因（72920581、72920627、72920639）位点甲基化水平高于低度萎缩组和中度萎缩组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。高度萎缩组miR-124a-3 基因（63178345、63178383、63178444）与NKX6-1 基因（84496965、84496893、84496884）位点甲基化水平高于低度萎缩组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表4。

3 讨论

胃癌多数是在癌前变化基础上发生，癌前变化分癌前疾病和癌前病变。目前对基因甲基化与胃癌状态的研究较多[14-17]，近年已有关于应用DNA 甲基化预测胃部疾病进展[18-20]、胃癌风险分层的DNA 甲基化积累及标记的相关报道[21-22]，并且近期相关研究[23]显示，血液中检测DNA 甲基化可比常规诊断提前4 年发现癌症（包括胃癌），但关于基因异常甲基化与胃癌癌前疾病的相关性仍需进一步探究。研究显示[9-10]，胃组织EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平可预测异时性胃癌发生风险，但缺乏与临床指标的关联性研究，本研究将进一步探讨这些基因甲基化在胃癌癌前疾病中的意义。

本研究结果显示，胃组织在胃癌癌前变化的不同状态中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因的甲基化水平有明显差异。慢性萎缩性胃炎甲基化水平明显高于慢性非萎缩性胃炎（P ＜0.05）；而无论是在慢性胃炎（病理分级）不同萎缩程度、慢性萎缩性胃炎（内镜分级）不同萎缩程度，还是在慢性萎缩性胃炎不同肠化程度的甲基化水平差异比较中，均表现为病情越严重状态的甲基化水平越高。提示胃癌癌前疾病在EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因上存在甲基化水平积累现象，即“慢性非萎缩性炎症→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→胃癌”[24]演变过程中，胃癌癌前疾病相关病情越重，甲基化水平越高，提示EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化可能在胃癌癌前疾病萎缩及肠化的进展过程中发挥重要作用，值得进一步研究。而在胃癌组织中EMX1、miR-124a-3、NKX6-1 基因甲基化水平未见明显升高，NKX6-1 基因甲基化水平甚至低于慢性非萎缩性胃炎与慢性萎缩性胃炎，提示癌症组织中甲基化水平有下降的趋势。研究显示[25]，NKX6-1 基因的甲基化可作为结直肠癌患者化疗效果的预测因子。