三阴性乳腺癌基因拷贝数变异与患者临床病理特征及预后的关系

李宇翔 丰锦春 吴 涛 阿孜古丽·阿布都热合曼 郁璐月 朱丽萍

新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区，新疆乌鲁木齐 830000

乳腺癌现居全球女性恶性肿瘤发病率的首位[1]。随着对乳腺癌在基因水平上探索的深入，为提高其治愈率与生存期提供了基础[2-3]，尤其是对侵袭性强、预后差且异质性高的三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的遗传变异的研究带来了新的突破[4]。影响TNBC 发生的相关危险因素中，基因拷贝数变异（copy number variation，CNV）与其联系相当紧密，CNV携带者有很高的乳腺癌发病率[5-7]，CNV 亚显微水平的变化与肿瘤的发生呈因果关系[8]。本研究旨在探讨CNV 与TNBC 患者临床病理特征和预后之间的关系，为TNBC 患者预后研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取新疆医科大学附属肿瘤医院（以下简称“我院”）2014 年1 月—2016 年1 月资料完整的86 例TNBC 患者为研究对象，中位年龄56 岁（32～81 岁）；根据中国临床肿瘤学会2019 年分期标准[9]，Ⅰ期5 例，Ⅱ期57 例，Ⅲ期24 例。患者入院后均与院方签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准，且标本均经病理诊断、免疫组化及FISH 检测验查。纳入标准：①初次行手术治疗的TNBC；②有完整临床和随访资料。排除标准：①术前接受放化疗；②合并其他恶性肿瘤，有恶性肿瘤病史。

1.2 方法

全外显子高通量平行测序技术检测CNV 情况。从癌组织及癌旁组织中提取DNA 样品，进行基因组DNA 片段化，利用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物芯片分析仪进行质控。PCR 扩增后通过Qubit 2.0 核酸蛋白定量仪对文库进行定量。测序所得原始数据双端序列比对到参考序列上，基于比较结果进行染色体结构变异的CNV 情况分析。

1.3 测序结果的判定

采用Control-FREEC[10]系统检测基因组片段的CNV 情况，检测结果中包括：拷贝数缺失、拷贝数扩增以及拷贝数正常的杂合性缺失。进行CNV 比较时需要将同一患者癌组织及癌旁组织样本配对并进行CNV 合并后再行检测，合并方法是使用CNVRuler[11]工具，最后录入每对组织样本中各条染色体中缺失、扩增、杂合性缺失的拷贝数及拷贝数总数。

1.4 随访

采用定期电话随访、门诊复查、入院复查记录的方式对患者进行随访，随访起始时间为患者手术当日，终止时间为死亡，截至2020 年1 月15 日，中位随访时间为38 个月，所有患者均获得有效随访资料。

1.5 临床资料的收集

收集患者临床病理资料，包括：①年龄；②TNM分期；③淋巴结转移情况；④原发肿瘤大小、组织学分级、Ki67 表达、月经情况；⑤恶性肿瘤家族病史；⑥总生存期、5 年生存率。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对所得数据进行分析。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。计量资料均数±标准差（）表示，采用独立样本t 检验。双变量关联性分析采用Pearson 积矩相关分析、Spearman 秩相关分析法，采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，组间曲线比较采用Log-rank 检验，多因素分析采用Cox 回归分析法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者CNV 分布情况

有效测序数据通过bwa-0.7.15[12]系统的SAM 格式比较，样本经配对合并后共存在5928 个差异CNV，其中扩增41.92%（2485/5928），缺失15.99%（948/5928），正常19.47%（1154/5928），杂合性缺失22.62%（1341/5928）。癌组织（4080 个，68.83%）与癌旁组织（1848 个，31.17%）CNV 分布情况比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。复发转移组在8 号染色体上有最频繁的CNV 扩增，无病生存组在17 号染色体有最频繁的CNV 丢失及杂合区域（图1）。snpEFF[13]软件对CNV 检测结果进行注释，样本中可能存在发生CNV 的基因型主要有BRCA1/2 基因（在8 号染色体缺失）、FGFR2 基因（在17 号染色体缺失）（图2）。

图1 CNV 在染色体上的分布示意图

图2 基因缺失在染色体上的分布

表1 患者CNV 分布情况比较（个）

2.2 CNV 与临床病理特征相关性分析

Pearson 相关性分析显示，CNV 与年龄、原发肿瘤大小、淋巴结转移情况呈线性相关（r=-0.87、0.92、0.94，P ＜0.05）。Spearman 秩相关分析显示，CNV 与TNM 分期呈正相关（r=0.83，P ＜0.01）。见图3。

2.3 生存分析

至随访结束，86 例中死亡15 例（17.44%），5 年总生存率为82.56%。8 号染色体发生CNV 者47 例，5 年生存率为74.4%；无CNV 者5 年生存率为92.3%，两组5 年生存率比较，差异有统计学意义（χ2=4.495，P=0.034）。见图4。17 号染色体发生CNV 者51 例，5 年生存率为74.5%；无CNV 者5 年生存率为94.3%，两组5 年生存率比较，差异有统计学意义（χ2=3.145，P=0.046 ）。见图5。Cox 多因素回归分析显示，CNV 情况、TNM 分期是TNBC 患者预后的影响因素（HR=0.456、1.927，P ＜0.0 5）。见表2。

图3 CNV 与病理特征相关性分析

图4 8 号染色体CNV 患者5 年生存率比较

3 讨论

评估肿瘤复发转移风险，并给予医学干预改善患者的预后，是乳腺癌研究领域的热点。常用的TNM 分期预后评价体系，存在明显的局限性。分子遗传学领域多项研究发现，16 号染色体长臂（16 q）拷贝数频繁丢失发生于乳腺癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤，16 q拷贝数全部或部分缺失的乳腺癌恶性程度高于非缺失者，并与预后存在明显的相关性[14]。Svetlana 等[15]研究认为CNV 的差异会影响患者的无病生存期，且存在大量CNV 患者在术后可能会较早复发转移。

图5 17 号染色体CNV 患者5 年生存率比较

表2 三阴性乳腺癌患者Cox 多因素回归分析

本研究对样本进行了CNV 检测，其中有4691 个基因在不同组织中存在突变，其原因可能是在肿瘤细胞减数分裂过程中，基因组上同一位点的DNA 序列能与其同源序列发生重组，即等位同源重组。但对于基因组上的重复序列，除同一位点上的同源序列外，不同位点上的重复序列也可能具有高度同源性，发生非等位的同源重组[16-17]。本研究样本经检测在负荷最高的8 号、17 号染色体上存在有BRCA1/2 基因、FGFR2 基因、KRAS 基因等基因的突变类型。癌细胞分裂后，据观察同源重组发生的位点不是随机分布在基因组上的，存在一定的序列倾向性，即重组热点，这可能导致了存在多重组热点的TNBC 患者会出现更多的CNV，进而影响其临床病理特征及预后。

癌组织样本中CNV 数目显著高于癌旁组织，这可能由于在疾病进程中，易复发的TNBC 原始癌细胞突变时细胞核异型性更明显，染色体上多对等位基因变异，在DNA 复制过程中存在更多的拷贝数大片丢失或扩增现象，从而带来更大的负荷，导致其组织学分级更高，发生淋巴结及全身转移的更早，对术后化疗敏感度降低，肿瘤恶性程度高且易复发转移。存在大量CNV 的患者术后肿瘤复发转移的风险高于较低数量CNV 的患者，这也提示TNBC 患者发生大量CNV与其预后有很高的相关性。大量研究结果显示，TNBC与其他类型乳腺癌的临床病理特征比较具有更明显的特征[18-20]。相关[21-22]研究认为TNBC 复发及死亡高峰期为术后5 年内，并与肿瘤分级、CNV 情况具有一定的相关性。基于DNA 重组机制与DNA 错误复制机制的基因组重排可以产生多种类型的CNV[23]，这也就导致了患者临床病理特征的差异，但是否CNV 种类越多，患者差异越明显，预后越差，还需提高CNV分辨率及基因组覆盖率后进一步探讨研究。

Miron 等[24]进行的前瞻性临床试验对1550 例原发乳腺癌患者的生存进行了分析，其中TNBC 患者5 年总生存率为81.0%，5 年无瘤生存率为84.0%，与本研究患者生存率相似。Zhang 等[25]在拷贝数改变负荷导致乳腺癌生存率的差异分析中认为，CNV 的携带者负荷最高的是1、8 和16 号染色体，且与乳腺癌生存率之间存在显著的关联。发现8 号染色体有最频繁的CNV 扩增，17 号染色体有最频繁的CNV 丢失及杂合区域，同时8、17 号染色体也是负荷最高的两条染色体，这与国内研究结果存在一定的差异。其原因可能是新疆处于我国西部边陲，是一个多民族聚居的地区。本研究中纳入了包括汉族、维吾尔族、哈萨克族、回族等7 种民族患者样本，由于民族的差异，在染色体发生CNV 的过程中，高负荷染色体结果可能因样本多民族种类产生差异，而在负荷较高的8、17 号染色体上发生CNV 的患者5 生存率显著低于未发生CNV的患者。因此，目前数据支持患者在8、17 号染色体差异CNV 可能作为TNBC 的预后指标，但CNV 导致的染色体变异是否与TNBC 的不良预后直接相关仍需要大量的研究，本研究由于样本量偏小尚不能确切论述CNV 与TNBC 患者预后的因果关系，还需要扩大样本量后进一步研究。