补肾法促干细胞归巢在骨质疏松中的应用

余富勇 余翔 乡晓岚 沈耿杨 尚奇

陈文敏1 汤凯1，2 陈桂锋1，2 王晓文1 江晓兵2* 任辉2*

1.广州中医药大学，广东 广州 510400 2.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405 3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨病[1]。老龄化是OP的危险因素，我国已经步入老龄化社会，且老龄人口依旧呈现增长趋势，OP发病率随之增长[2]。OP的治疗消耗了家庭和社会的较大精力和财富。目前，防治OP的药物并不能满足当前的需求。干细胞疗法是目前治疗OP的一种新兴疗法，国内外已有研究报道了干细胞移植可有效防治OP[3-4]。干细胞移植后，可归巢到OP局部损伤区域，但目前干细胞移植后存在归巢效率不佳的问题，从而限制了干细胞的治疗效果，成为干细胞治疗OP的瓶颈之一。

因此，为提升干细胞移植治疗OP的疗效，提升干细胞归巢效率具有不可忽视的重要意义。近年来的研究发现，补肾法能够有效促进骨再生[5]，补肾中药和方剂在促进干细胞归巢方面发挥着重要作用。因此，探究补肾法促干细胞归巢在骨质疏松中的应用具有重要意义。本文拟探讨补肾法促干细胞归巢在骨质疏松中的应用前景。

1 补肾法治疗OP的中医内涵

OP属于中医古籍所载的“骨痿”“骨枯”[6]。《素问》记载：“肾者……精之处也……其充在骨”，《医经精义》云：“肾藏精，精生髓，髓养骨”，OP多由肾虚所致，肾精渐衰导致骨髓无力生化，骨量稀少，引发OP。因此OP的治疗关键是补肾。中医多从补肾阴、补肾阳治疗OP。《素问》中提出“阴在内，阳之守也；阳在外，阴之使也”。阳化气不足，骨髓无力生化，进一步使阴成形受损，致使骨质形成功能降低，是“阴阳失衡”引发OP的重要过程。补肾法通过补充肾精激发“阳化气”功能，进而改善“阴成形”能力促进骨再生，恢复丢失的骨量，治疗OP。本文重点论述补肾法激发“阳化气”功能阶段的机制。

2 干细胞的归巢机制

归巢是一个协调的多步骤过程，包括滚动、内皮细胞粘附及最终由选择素和整合素介导的跨内皮细胞迁移[7]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)最常用于OP的治疗，其壁龛位于血管壁附近，骨小梁的内表面，在纤维间隙内，少量存在于脐血、牙组织、滑液和肌肉中，因此可能从血流、骨髓、肌肉或骨膜中迁移[8]。目前，干细胞归巢的机制并不明确。在归巢的启动研究方面，主要围绕基质细胞衍生因子(stromal cell derived factors，SDF-1)与CXCR4轴展开，迁移的过程与整合素及钙粘蛋白密切相关，迁移后的细胞行为也会对归巢产生影响。

2.1 干细胞归巢与SDF-1/CXCR4轴

干细胞的迁移通常由组织释放的信号分子启动，其中SDF-1/CXCR4备受关注。SDF-1与CXCR4的表达在一定程度上提示了干细胞的归巢能力，且与年龄及OP密切相关，年轻大鼠中的MSCs向SDF-1迁移的能力及CXCR-4的表达水平高于成年大鼠，显著高于OVX大鼠[9-10]。Chen等[11]用荧光标记法在小鼠体内输注Aln-Lipo-SDF-1，生物光子成像显示其在骨组织中积聚，且移植的GFP+MSCs被骨髓吸引，SDF-1表达上调触发了MSCs迁移，促进骨再生。这表明通过对SDF-1的修饰，可促进归巢，提高骨量，进一步证实了SDF-1与MSCs迁移的紧密联系。

SDF-1的趋化作用也受趋化细胞CXCR4表达水平的影响，表达水平越高，归巢能力越高，且SDF-1对不表达CXCR4的细胞不具有趋化归巢的作用[12]。Sanghani等[13]用CXCR4转染MSCs并注射到OVX大鼠中发现，CXCR4转染能够显著提高OVX-MSCs的CXCR4的表达(从19%到40%)，仅能较少提高年轻大鼠MSCs的CXCR4表达(5%)，未转染的年轻MSCs能够高表达内源性CXCR4(92%)。年轻MSCs能够具有高表达CXCR4的能力，因而，Sui等[14]认为，移植年轻或健康MSCs治疗OP时，无需用CXCR4进行转染。

2.2 干细胞归巢与细胞间接触

通过SDF-1/CXCR4轴启动MSCs归巢后，为了使细胞迁移，必须破坏细胞与细胞之间、细胞与基质之间的接触，为此，需通过局部释放酶来破坏钙粘蛋白和整合素的接触。整合素α4β1结合纤维粘连蛋白和血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)可促进干细胞的迁移，且用其拟肽制配体与对骨有高度亲和力的药物结合可改善骨髓间充质干细胞的归巢，增加骨膜部位的骨形成[1]。破坏细胞原有接触的过程也与AKT的活化有关，AKT可能通过增加肌动蛋白和肌球蛋白的分泌促进骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)的迁移，也可能与降解细胞外基质及基底膜有关。Liu等[9]用ADM3100(SDF-1阻断剂)预处理细胞对SDF-1表达进行观察后发现，细胞磷酸化AKT(p-AKT)的水平降低。这些结果表明干细胞在相应的条件下可以破坏细胞间、细胞与基质间原有的接触，促使迁移的发生。

2.3 干细胞归巢与成骨分化

干细胞迁移后发生成骨分化时，成骨相关因素也对MSCs的迁移产生影响。汪伟等[15]的研究表明，Runx2基因过表达可能激活了CXCL12(即SDF-1)/CXCR4信号轴，从而促进了MSCs的体外迁移。但是当MSCs分化为成骨细胞后，SDF-1/CXCR4信号轴对已分化为成骨细胞的MSCs将不再具有趋向性。Sanghani-Kerai等[10]的研究也表明，转染CXCR4的MSCs分化为成骨细胞后，尽管其能够表达CXCR4，但并不向SDF-1迁移，这可能与分化后细胞外基质的沉积及基质金属蛋白酶使SDF-1失活有关。可见，SDF-1/CXCR4是启动干细胞归巢的关键轴之一。归巢启动后，整合素与钙粘蛋白的结合降低破坏了细胞与细胞、细胞与基质的接触，促进了干细胞的归巢。然而，迁移后的干细胞成骨分化后，其迁移能力将会降低。这种现象可能与细胞外基质的沉积及基质金属蛋白酶的分泌使SDF-1失活有关。相关激素的运用也能够促进干细胞的迁移，但该方面的研究较少，其机制尚不明确。

3 补肾法促干细胞归巢

先天之精具有干细胞的属性。干细胞是肾精在分子水平的表现形式[16]。先天之精不足导致干细胞的“阳化气”功能受损，使干细胞归巢能力减弱，进而影响“阴成形”功能。补肾法可补充肾精并激发机体“阳化气”功能促进干细胞归巢，进而促进干细胞“阴成形”的成骨功能，恢复丢失骨量，从而治疗OP。当人体处于疾病状态，干细胞的“阳化气”功能降低，自身的干细胞无法满足促进损伤组织修复的需求，需要进行外源性干细胞注射，但其归巢效率低[17]，需要通过补肾法激发干细胞“阳化气”功能改善归巢效率。补肾法可通过激发内外源性干细胞的“阳化气”功能促进干细胞的归巢。

3.1 补肾法促内源性干细胞归巢

3.1.1补肾中药促内源性干细胞归巢：大量研究证实补肾中药在促进内源性干细胞归巢中发挥着重要作用，且主要与生长因子及干细胞表面受体的表达相关。具有补肾功效的中药牛膝提取物杯苋甾酮能够上调干细胞CXCR4的表达，进而激发大鼠BMSCs体外迁移[18]。补肾中药淫羊藿提取物淫羊藿苷也具有促进MSC迁移的能力，进一步实验运用CXCR4的拮抗剂AMD3100处理后，这种迁移能力被阻断[19]。此外，补肾中药熟地提取物[20]、骨碎补总黄酮[21]、骨碎补柚皮苷[22]均能够上调SDF-1/CXCR4的表达，进而促进干细胞的迁移。赵志虎等[22]的研究进一步表明，骨碎补柚皮苷促进MSC迁移的能力可能通过SDF-1α/CXCR4/PI3K/Akt信号通路实现。以上结果证实了补肾中药可促进内源性干细胞的迁移，而这种能力与SDF-1/CXCR4轴密切相关。

3.1.2补肾方剂促内源性干细胞归巢：内源性干细胞归巢能力减弱是引起OP的重要因素。补肾方剂在促进内源性干细胞归巢、抗骨质疏松中发挥着重要作用。王华伟等[23]的研究表明，补肾化瘀生新方可能通过促进BMSCs归巢参与了组织的修复。此外，补肾益精方[24]、补肾活血汤含药血清[25-26]均被证实能够启动SDF-1/CXCR-4信号轴促进BMCs的迁移。

研究发现，补肾活血汤促进BMSCs的能力与单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和趋化因子受体-2(CC chemokine receptor 2，CCR2)相关[27]。吴志方等[28-29]的研究表明，补肾活血汤4种有效提取物(石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物)均能促进大鼠BMSCs体外迁移，这种促进迁移的能力可能与MCP-1/CCR2上调Wnt5a的表达有关。黄永铨等[30]的研究也表明，补肾活血汤的促MSCs体外迁移能力可能与MSCs表面的受体CCR2相关。此外，蔡炎等[30]的研究则表明，这4种提取物在具备各自最佳浓度时均可成为活性部位，且可能通过BMSCs表面相关受体人胰岛素样生长因子2受体提升迁移能力。石油醚部位提取物还可能通过下调miR-539及靶向Wnt5a信号通路促进MSCs迁移[31]。钱伟宏等[32]的研究表明，补肾活血汤还可能通过CXCL13/CXCR5信号轴及SDF-1/CXCR4信号轴参与了BMSCs迁移的促进。

温阳补肾方在促干细胞归巢、抗OP中也发挥着重要作用。血小板衍生生长因子(platele derived growth factor，PDGF)已被证实可促进内源性MSC迁移[33]。相关实验已经证明，将VCAM-1抗体与小鼠MSC表面结合能促进MSC向骨髓的归巢。吴多艺等[34]、罗贤红等[35]分别对146例、60例骨质疏松骨折恢复期患者随机分组，运用中医温阳补肾方治疗3个月、1个月后均发现，患者的血清骨钙素、PDGF与类胰岛素一号生长因子显著升高，血清VCAM-1降低，骨密度增加，提示温阳补肾方可促内源性干细胞归巢，从而促成骨，提高骨密度，且与PDGF、VCAM-1密切相关。

此外，“补肾活血舒筋方”也具有促进BMSCs迁移的能力，且可能与NF-κB、CXCR4有关[36]。补髓生血颗粒也能够促进细胞的迁移，这可能与调控Src/PLC/IP3通路及调控异常Ca2+[37]或调控FAK/PI3K通路及Rho GTP酶有关[38]；也可能与调节VLA-4和VLA-5 mRNA相关[39]。

以上大量的研究证实了补肾中药及补肾方剂能够通过调节干细胞归巢的各个阶段促进内源性干细胞的归巢。

3.2 补肾法促外源性干细胞归巢

OP患者处于疾病状态，内源性干细胞功能不足或缺乏，因此，外源性移植是较好的治疗策略[17]。补肾法在促外源性干细胞归巢中发挥着重要作用，徐志明等[40]等运用补肾活血汤联合静脉注射PKH26标记的BMSCs发现，补肾活血汤促进移植后的外源性BMSCs向大鼠骨折断端迁移。笔者的前期研究[41]运用补肾中药龟板灌胃联合静脉注射BrdU标记的BMSCs发现，龟板显著促进了外源性BMSCs归巢，减少了椎体骨量的丢失，对绝经后骨质疏松起到了有效预防作用。以上研究提示补肾法能够有效促进外源性干细胞的归巢。

综上，补肾法能够促进内源性干细胞及外源性干细胞的归巢，更好发挥出干细胞的治疗作用。

3.3 补肾法促干细胞归巢抗OP的机理

《类经》云：“阳动而散，故化气，阴静而凝，故成形。”干细胞的归巢与“阳化气”有着密切的联系，补肾法促干细胞归巢治疗OP的关键在于“补肾阳”，增强“阳化气”的功能，使得“阳生阴长”，增加骨量抗OP。

“补肾”在促干细胞迁移中发挥着至关重要的作用。李杰斌等[42]研究证实，补肾益精方左归丸能够调控衰老大鼠BMSCs归巢，且检测到干细胞生长因子分泌的增加。补肾法能够通过调控SDF-1/CXCR4轴改善骨的损伤，Lien等[43]将表达CXCR4的MSCs分别经髓内和尾静脉注射入免疫活性C3H/HeN小鼠体内后发现，其归巢率和骨量保留率较高，提示补肾法可促进MSCs归巢抗免疫保留骨量。此外，小剂量BMP-2和SDF-1α联合应用可增加损伤部位原代MSCs募集来促进骨愈合[44]。而将CXCR4和一种成骨分化调节的主转录因子核心结合因子——核结合因子α1共转染在BMSCs上，也增强了BMSCs对OP的治疗作用[43]。SDF-1/CXCR4在启动成骨过程中起着重要作用[45]，而成骨分化途径启动后，SDF-1/CXCR4轴将不再需要[10]。这些结果表明，补肾法通过SDF-1/CXCR4轴促进了MSCs的归巢，且参与了成骨。但归巢的MSCs在分化过程中并不同步[46]，可能是因为在治疗的不同阶段迁移到缺陷部位，从而处于不同的分化阶段。汪伟等[15]的研究进一步表明CXCL12基因转染可在早期促进MSCs向成骨细胞分化，而在MSCs向成骨细胞分化的中后期无明显影响。李汪洋等[47]的研究则表明补肾活血汤在骨折不同时期发挥的促迁移作用趋势并不一致，早期和晚期分别以低浓度、高浓度作用明显促进，而中期则是抑制，这种趋势不一致与CCL12/CXCR4的表达有着密切关系。这些结果表明促进迁移后，干细胞将进行成骨的相关表达，在短期降低迁移，而后增加补肾力度可再次促进干细胞的归巢。

Sui等[14]将绿色荧光蛋白(GFP)标记的骨髓间充质干细胞(BMSCGFP)注射到小鼠体内后发现BMSCGFP输注以部分凋亡为代价阻止了内源骨髓细胞凋亡，且BMSCGFP的凋亡率小于30%，其余大部分BMSCGFP仍能继续发挥作用，且在4周后归巢定居后的大约40%的BMSCGFP接受成骨分化为Osx+成骨细胞祖细胞，提示补肾法可能促MSCs归巢抗凋亡促进成骨的作用。

以上的补肾中药及方剂均能在一定程度具有温补肾阳的作用。综上，SDF-1/CXCR4信号轴促进干细胞迁移能力与补肾法中的“阳化气”功能具有较多相似的内涵，是补肾法“阳化气”功能在分子水平的表现形式。因此，本研究认为补肾法能够通过激发干细胞“阳化气”的功能激活SDF-1/CXCR4信号轴促进MSCs的归巢，并可能通过参与抗免疫、抗凋亡或直接成骨分化防治OP。

4 小结及展望

干细胞治疗是当下研究的热点，干细胞具有“肾精”属性。补肾法能够激发干细胞“阳化气”的功能激活SDF-1/CXCR4轴，促进干细胞归巢防治OP。归巢后的干细胞可通过调节骨免疫、抗凋亡等途径为具有“阴成形”特征的骨形成创造有利环境或成骨分化直接参与成骨抗OP。以往的研究表明了补肾法在促干细胞归巢中的重要作用，但依旧有许多问题有待解决。如：(1)MSCs的骨归巢仍未有公认迁移分子且归巢机制不明；(2)MSCs移植后的“肺首过效应”“血液清除”效应难以避免，降低了归巢效率；(3)补肾中药成分众多，有效成分提取及鉴定存在困难；(4)MSC归巢过程及归巢后行为机制尚不完全明确；(5)MSCs迁移能力与成骨分化的相互作用机制研究较少；(6)内分泌、旁分泌效应如何影响干细胞归巢研究较少。

针对这些问题，通过补肾法促进MSCs归巢促进骨再生研究的前景包括：(1)构建荧光标记MSC，利用成像系统实时观察MSC在体内的迁移，为MSC在体内的迁移提供直接证据并寻找迁移因子；(2)探索“肺首过效应”及“血液清除”的机制，为提高干细胞归巢效率提供参考；(3)进一步开展中药有效物质提取及鉴定的研究；(4)结合当下MSCs内分泌、旁分泌研究热点进一步探讨MSCs的归巢及归巢后成骨分化机制；(5)进一步发掘和完善干细胞归巢的中医理论基础。