高原型实验小型猪——合作小型猪的培育与应用

景志忠，房永祥，陈国华，贾怀杰，何小兵，李军成，高真贞，莫斯科，冯海燕，王春燕，李守杰，曾 爽，杨 帆，高建平，姚文娟，李政厅，景 伟，曹健民，张春祥

（中国农业科学院 兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室，甘肃 兰州 730046）

近交系实验动物由于遗传背景清楚、基因均一、个体间差异小、科学实验重复性强等，被誉为“生命天平”“活的试剂”，广泛应用于遗传学、免疫学和感染性疫病研究以及生物制品的质量检验中，是科学技术研究和应用的重要基础和支撑条件。由于家猪体型壮大，在试验操作、微生物的环境控制及饲养管理等方面均不方便，因此早在20世纪50年代美、德、法、日等国家就专门培育出十几个小型猪品系（通称Mini Pig）用于科学研究。我国在20世纪80年代对南方地方原始品种，如贵州香猪、西双版纳小耳猪、广西巴马猪、海南五指山猪等小型猪品系资源进行了挖掘和利用，培育实验用小型猪，在近交系、SPF实验用小型猪的培育与应用方面取得了世界领先成果[1,2]。

合作猪（Sus scrofa）（Hezuo Pig），俗称蕨麻猪、藏猪等，体型矮小，具有适应高原环境、抗逆性强等特性，是我国珍贵的北方地方猪品种，但合作猪毛色杂、野性大、攻击性较强，不符合实验动物要求。如何在保证合作猪矮小基因稳定遗传的同时，培育单一毛色的纯种猪品系是实验动物化利用的前提和难点[1-3]。本研究拟通过全同胞或半同胞近交封闭繁殖，分离或淘汰不需要的遗传特性，保留优良遗传特性，有针对性地筛选体型矮小和毛色单一的合作猪，建立符合实验动物标准的近交系合作小型猪品系，可用于医学、兽医学基础理论研究和产品开发，填补高原型小型猪这一国际空白。

1 合作猪的基本特性与利用优势

合作猪又称蕨麻猪，因采食蕨麻（Potentilla anserina）而得名，也称藏猪或山猪，是甘肃、青海、四川、云南、西藏等省（区）藏族地区饲养的一种小型原始地方猪品种。合作猪主要分布在甘肃省西南部、青藏高原东部边缘，中心产区在甘南藏族自治州的合作市以及周边夏河、碌曲、卓尼等县，因而1984年被定名为合作猪[4]。

1.1 品种形成环境与特点

合作猪的生存条件非常恶劣，长期生长在高寒气候（最低气温-28℃，最高气温27.7℃，年平均温度1～7℃，温差较大）和低劣的饲养条件下（终年以放牧为主，采食蕨麻等牧草的根、茎、籽及农作物的秸秆等），具有体质结实、四肢健壮、性野、行动敏捷、鬃长和绒毛密生等特点。由于其地处偏僻山村，长期自繁自养封闭繁殖，未受外来血缘的影响，因此形成了一个遗传相对稳定、均一的原始地方猪种。但合作猪体型小、生长缓慢，在畜牧业生产中使用价值不大。据2000年之前的不完全统计，甘南州“合作猪”的数量仅有6万多头，且大部分地区的合作猪已被杂交，猪种血缘混乱，致使这一珍贵种质资源濒临灭绝，亟待保护[3][5,6]。近年来，随着合作猪生物学价值和食用价值被重新认识，其优秀的抗逆性和肉质特征以及适于实验动物化利用的优势，成为未来发展的方向。

1.2 品种基本特征

合作猪体型较小，性情野，行为机灵活泼[3][5,6]，毛色纯黑的少，一般四肢、腹部、背部等部位为白色，被毛粗密而长，冬生棕色绒毛，鬃长且坚韧。初生仔猪背部毛色带有棕黄色或褐色纵行条纹（松鼠背色），随日龄增长而逐渐消失。合作猪头窄长，呈锥形，嘴长而尖，犬齿发达，耳小向上直立，额无明显皱纹，颈和体躯较短，胸较狭窄，背腰平直或微弓，后躯较前躯略高，臀窄而倾斜，四肢长短适中，健壮，跟系短而有力，蹄小坚实；乳头4～6对，排列整齐。成年公猪体重约33.31 kg，母猪约34.84 kg。母猪4～5月龄开始配种，产仔数较少（平均3.6头），繁殖率较低。合作猪日增重较低，约210.01 g/d，料肉比偏高，达3.51∶1。

1.3 实验动物化利用前景

合作猪体型小，品种纯，遗传稳定，易于微生物学质量控制，由于分布在偏僻的高原地带，很少受外来血缘的影响，一般未能进行杂交改良用于畜牧业生产，因此保存了原始的、均一的矮小基因库，且遗传背景比较清楚，可培育出国内外独特的高原型小型猪新品系。目前培育成功的贵州小型猪（Guizhou Mini-pig）、版纳小型猪（Banna mini-pig）、巴马小型猪（Bama mini-pig）和五指山小型猪（Wuzhishan mini-pig,WZSP），均来自低海拔、高湿度及高温度地区，合作猪则生长在截然不同的自然环境。

若能对合作猪进行实验动物定向培育，使之保持体型小、抗病性强等特点，且具有其他品种的优良繁殖性能，符合实验动物科学的需要，如遗传均一性、微生物可控性以及实验可重复性等，可望培育成国际上更为理想的实验小型猪品系，以满足生产产品质量检验以及对生命科学研究的需要，具有十分广阔的应用前景[3][5,6]。

2 合作小型猪的培育过程与遗传控制

2004年中国农业科学院兰州兽医研究所从夏河县等地引进2头3～4月龄的1公1母仔猪（兄妹）和1母猪带仔5头（母猪全黑，约1～2岁；仔猪约20日龄，1头为松鼠背，其余4头为黑色或六端白即白蹄、白尾、白额头），在兰州进行异地适应性饲养和观察。按照“合作猪实验动物化培育、近交系培育和SPF（Specific

pathogen Free）化培育”的三阶段总体设想和长远布局，在国家和甘肃省科技计划的支持下，先后开展了中国合作小型猪实验动物化培育及分子遗传特性研究（1004TCYA001）、近交系合作小型猪的培育及其分子遗传特性研究（1207TCYA025）、疫病易感型小型猪动物模型研究（2017YFD0501606）等项目，重点对其生活习性、生长发育、繁殖性能和抗病性进行观察，同时采用现代分子生物学、分子遗传学和分子免疫学技术对其生长发育控制和免疫抗病关键分子进行遗传特征研究与监测，培育出了标准化的实验合作小型猪，并在生命科学研究中推广应用。

2.1 实验合作小型猪的培育

2.1.1 合作猪的驯化与适应性培育 根据实验动物学的质量要求，制定了合理的合作猪饲养、驯化以及管理规范[7]，在非产地（兰州市，海拔1 500 m，温度15～28℃）进行了舍饲环境适应性饲养（配合饲料自由采食和饮水），观察其外貌特征及生活习性，并监测合作猪的生长发育、生产性能和生理生化指标的变化。研究发现，合作猪在饲养和培育至F6～7代时，其野性逐渐消失，吻突变短，绒毛减少，体型钝圆，毛色光亮，未因营养、环境优越而出现体重、体型明显增大的现象，为实验合作小型猪的标准化培育提供了依据。

2.1.2 近交系合作小型猪的培育 按照近交系实验动物遗传控制标准（甘肃省地方标准DB62/T 4074-2019），采用“兄妹”或“父女”交配的方式进行近交繁育，追踪性地观察并监测其外貌特征、生长发育及生产繁殖性能指标。经封闭近交定向培育，已近交培育到F15～16代，其遗传性状日趋稳定，初步建立了全黑、六端白、松鼠背和大黑白花合作小型猪4个近交家系的种群繁殖单元，总种群达50头以上。同时制定、发布和实施了甘肃省地方标准《实验用合作小型猪繁育技术规程》（DB62/T 2897-2018）、《实验用合作小型猪遗传质量控制》（DB62/T 4074-2019）、《实验用合作小型猪微生物学、寄生虫学等级及监测》（DB62/T 4075-2019）、《实验用合作小型猪饲养环境和设施要求》（DB62/T 4076-2019）、《实验用合作小型猪病理学检查规范》（DB62/T 4360-2021）和《实验用合作小型猪配合饲料要求》（DB62/T 4359-2021），以指导近交系合作小型猪的扩群繁殖与生产[7-12]。

2.1.3 封闭群合作小型猪的培育 对合作小型猪的培育是以近交小型猪的种群繁殖单元为基础，严格根据封闭群的遗传标准和要求，重点建立了六端白、全黑、松鼠背3个封闭群单元以扩展繁殖，种群60头，生产提供800多头实验用合作小型猪，以用于生长发育分子遗传特性研究、免疫和抗病特性研究以及疫苗质量评估，进而探讨作为实验动物的可行性。通过一系列的实验应用，结果显示，与商品猪相比，培育的合作小型猪具有清晰的遗传背景、明确的微生物携带情况及基因纯等特征，试验结果均一、重复性好，适合作为感染、免疫机制以及疫苗质量评价的靶动物模型[13-23]。

2.1.4 实验合作小型猪的生产 按照实验用合作小型猪的饲养繁殖标准以及饲养环境和设施要求、遗传控制和微生物质量控制标准，在甘肃省兰州和静宁两地同时进行保种、培育和扩大生产。在饲养管理过程中，通常情况下不给猪群接种任何疫苗，这为培育和生产非免疫或SPF合作小型猪的培育和生产创造了条件。

2.2 合作小型猪的生理生化指标监测与特征

2.2.1 生理指标监测与特征 采集试验猪外周血共92头份，其中近交培育的合作小型猪58头份，原产地合作猪34头份。抗凝血用全自动兽用血液细胞分析仪，共检测12项血液生理指标，分别为红细胞数目（RBC）、白细胞数目（WBC）、红细胞压积（HCT）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板数目（PLT）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）。

近交培育的合作小型猪与原产地合作猪的血液生理指标比较显示，除RDW-CV指标外，近交培育的合作小型猪大多数指标都高于原产地合作猪的指标，其中WBC指标存在差异（0.01≤P＜0.05），PDW和MCH指标差异显著（0.001≤P＜0.01），HGB、HCT、MCV、RDW-CV、PLT、MPV、PCT指标差异极显著（P＜0.001），RBC和MCHC指标差异不显著。

2.2.2 生化指标监测与特征 采集试验猪外周血共92头份，其中近交培育的合作小型猪58头份，原产地合作猪34头份。血清经过全自动生化分析仪共检测16项血液生化指标，分别为总蛋白（TP）、白球比（A/G）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、钙（Ca2+）、无机磷（P）、尿素氮（BUN）、淀粉酶（AMY）、葡萄糖（GLU）、胆固醇（CHOL）、总胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）、肌酐（CRE）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮/肌酐比（BUN/CRE）。

将近交培育的合作小型猪与原产地合作猪的血液生化指标进行比较，结果显示，近交培育的合作小型猪的ALB、A/G、Ca2+、AMY高于原产地合作猪，而P、CHOL、TBIL、BUN/CRE、ALT酶含量指标低于原产地合作猪。其中ALB、Ca2+、P、AMY、CHOL指标差异极显著（P＜0.001），A/G、TBIL、BUN/CRE指标差异显著（0.001≤P＜0.01），TP、GLO、GLU、BUN、ALT、ALP、CRE、CK 8项指标无显著差异。

近交培育的合作小型猪已在低海拔地区繁殖15代左右，经检测，其生理、生化指标基本与原产地合作猪相似，但一些表征动物生存及适应高原地区环境的重要指标升高，说明近交培育的合作小型猪仍然保持着原产地合作猪良好的异地生存适应能力[24]。

2.3 合作小型猪遗传稳定性控制与特征

2.3.1 合作小型猪的染色体核型分析与特征 随机无菌采集近交系合作小型猪（公、母各半）的抗凝血，37℃恒温培养68～72 h，在终止培养前2～3 h加入秋水仙素溶液使细胞分裂停止在中期，在显微镜下观察细胞染色体的形状、数目和核型。证实合作小型猪体细胞染色体为2n=38（性染色体以X、Y表示，故用XX代表母猪，XY代表公猪），共19对，其中合作小型猪常染色体18对，性染色体1对，与原产地合作猪以及其他相关报道相同。根据染色体的相对长度、着丝点指数和臂比，将18对常染色体分为A、B、C、D 4个形态组，分别用1～18号标记合作小型猪的染色体核型，其中A组由5对（1～5号）染色体组成，属于近中着丝点染色体（sm）；B组由2对（6～7号）染色体组成，属于近端着丝点染色体（st）；C组由5对（8～12号）染色体组成，属于中着丝点染色体（m）；D组由6对（13～18号）染色体组成，属于末端着丝点染色体（t）。性染色体X、Y染色体均属于中着丝点染色体，X染色体大小介于8号、9号染色体间，Y染色体是最小的中着丝点染色体，较易辨别。合作小型猪染色体核型特征基本与其他猪种相同。

2.3.2 合作小型猪的生长激素基因与遗传特征与动物生长发育和控制有关的分子较多，其中生长激素是控制动物生长发育的关键分子，故在基因组DNA和RNA水平对其生长激素基因进行分子结构、多态性和遗传特征研究。

2.3.2.1 合作小型猪生长激素基因组的结构特征。从合作小型猪基因组DNA中可扩增出1 671 bp的猪生长激素基因序列，全长包含5个外显子和4个内含子，外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10 bp、161 bp、117 bp、162 bp和201 bp，内含子1、2、3和4的碱基数依次是244 bp、210 bp、192 bp和277 bp，外显子和内含子间的剪切序列符合GT-AG规则。合作小型猪生长激素功能基因全长651 bp，推测编码216个氨基酸的前体蛋白，成熟蛋白由190个氨基酸残基组成，属于分泌性蛋白。与参考序列比对，外显子中取代和缺失的碱基数合计为4 bp，内含子中取代和缺失的碱基数合计为15 bp，说明内含子的序列多态性大于外显子[25,26]。

2.3.2.2 合作小型猪生长激素功能基因的多态性特征。为探讨合作小型猪的遗传多态性，选择GenBank中猪生长激素基因序列14条作为参考序列，与合作小型猪的5条生长激素基因序列进行比较，其多态性主要表现在内含子1有1个转换和1个颠换，内含子2有2个转换，说明合作小型猪个体间的差异可能与其内含子的关系更密切。合作小型猪与其他14种猪之间在编码区和非编码区共检测到核苷酸变异155个，其中内含子中有119个，外显子中有28个，5'端有8个。在所有的核苷酸变异中，其中颠换104个，转换14个，缺失23个，插入14个。在出现的碱基取代位点中，大多数是颠换型突变，颠换与转换之比为7.43∶1，存在颠换偏移现象。对合作小型猪生长激素基因同源性和趋异性进行分析发现，合作小型猪与国内其他小型猪同源性较近，与大型猪同源性较远。15种猪生长激素基因遗传演化分析表明，合作小型猪与Vize猪有较远的亲缘关系，与贵州榕江香猪亲缘关系最近[27,28]。

2.3.3 合作小型猪的遗传演化关系与特征

2.3.3.1 合作小型猪与其他猪种群间的遗传演化关系。用9个（SW769、S0005、SW781、SW1653、SW1032、MN006、MN004、SW1876和SW1355）微卫星DNA座位对5个猪群体（合作小型猪以及兰州、武威、临洮和青海4个杂种猪群）的125个个体的平均等位基因频率、遗传距离DA、标准遗传距离DS，主成分PC1、PC2、PC3值进行遗传检测。研究结果表明，5个猪群体共检测到148个等位基因，所有猪群体等位基因数在55～100个间，其中青海猪群中最多为100个；合作小型猪群中最少为55个，说明青海猪群多态性高，合作小型猪群多态性低。其次，合作小型猪群体与兰州白杂猪群体不但遗传距离值最大（DA=0.678 1），而且标准遗传距离DS值仍最大，达到1.331 2。主成分分析显示，PC1、PC2和PC3分别占比62.17%、16.89%和10.94%，其中第1主成分PC1与合作小型猪有较大的正相关，与其他呈较大的负相关，它代表合作小型猪；第2主成分PC2与兰州白杂猪有较大的正相关，与其他呈负相关，它代表兰州白杂猪群体；临洮、青海和武威等3个杂种猪群体在PC1、PC2坐标中具有较近的距离，表明临洮、青海和武威这3个杂种猪群体有相似的主成分。这些结果说明合作小型猪群体在遗传上远离兰州白杂猪群体，更远于临洮、青海和武威3个杂种猪群体，没有杜洛克、长白、约克夏等西方猪血缘，是一群比较理想的自繁群体[27,28]。

2.3.3.2 合作小型猪与原产地猪群间的遗传演化关系。用10个（S0005、S0009、SW769、S0218、CGA、SW240、SW72、SW857、S0355、SW24）微卫星DNA座位对近交培育14、15代的合作小型猪（松鼠背、全黑、大白花、六端白）与原产地合作猪群体共计55个个体（其中近交系合作小型猪35头，原产地合作猪20头）的等位基因数进行微卫星短串联重复序列标记技术（short tandem repeat，STR）遗传检测。研究结果表明，近交系合作小型猪群体不同家系的等位基因数平均为24个，原产地合作猪群体等位基因数为71个，其中近交系全黑、六端白家系猪群中等位基因数均最多为26个，大白花猪群中的最少为19个，松鼠背猪群中为25个，说明原产地合作猪群体的多态性高，而近交系合作小型猪群体的多态性低，且单一近交家系的等位基因数更少，高度纯合，符合近交培育小型猪的遗传特征。

总之，通过重点分析合作小型猪染色体核型及其生长激素基因的分子组成结构和多态性，探讨遗传与营养和环境对合作小型猪生长发育控制的影响，初步证实了合作小型猪生长发育稳定、体型小的特性，主要由遗传基因控制，而非营养、气候环境因素决定。

3 合作小型猪在抗病免疫研究中的应用

机体对病原微生物感染的防御是由天然免疫系统和获得性免疫系统介导的，其中天然免疫在机体的非特异性抗感染免疫过程中发挥着至关重要的作用，是机体抵御病原感染的第一道防线。获得性免疫是由T细胞和B细胞介导的针对病原成分而启动的特异性细胞免疫和体液免疫应答，发挥着重要作用。可利用已培育的合作小型猪对其抗病免疫关键分子，如主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）或猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA,Ⅰ类和Ⅱ类分子）、T细胞抗原受体（Tcell antigen receptor,TCR）以及模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）和细胞因子（cytokine）家族分子基因进行系统研究，探讨其基因结构组成、多样性与抗病分子遗传特征，从而为免疫抗病基础研究提供理想的动物模型。

3.1 在猪天然免疫细胞因子中的研究应用

机体免疫系统的应答程度决定了其能否阻挡病原的感染，并阻碍感染的进一步发展，而其效应机制主要是通过高活性多功能的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白等细胞因子来实现，大多数细胞因子以旁分泌、自分泌或内分泌的形式发挥其生物学效应。目前按其主要生物学功能分为白介素（interleukin,IL）、干扰素（interferon,IFN）、集落刺激因子（colony stimulating factor,CSF）等6大类。合作猪是适应性和抗逆性较强的猪种，由于细胞因子是免疫抗病的主要效应分子，因此从其抗病免疫相关的细胞因子研究入手探讨合作小型猪与抗病的关系。

以合作猪为研究对象，通过建立刺激诱导转录RT-PCR扩增法、cDNA表达文库法的克隆发现抗病免疫相关细胞因子基因的技术，先后克隆、表达和鉴定分析了猪白介素家族的IL-2、4、6、12、18基因[29-36]，猪干扰素家族的IFN-α/γ基因[37,38]，集落刺激因子基因CSF[39]，CD58（cluster of differentiation 58，CD58）基因[40]以及CD4/CD8分子基因等[41-43]，为高通量筛选和发现未知细胞因子或其他相关分子奠定了基础。

3.2 在猪天然免疫模式识别分子中的研究应用

由于模式识别受体是近20年来才发现和定义的与机体天然免疫最重要的、最直接的相关分子，目前已先后发现TOLL样受体（Toll-like receptor,TLR）、RIG-I样受体（RIG-I like receptor,RLR）、NOD样受体（NOD-like receptor,NLR）、AIM2样受体（AIM2-like receptor,ALR）、C型凝集素受体（Type C lectin like receptor,CLR）、胞质DNA识别受体家族如cGAS（cGAMP synthase）等，故以这些模式识别受体及其信号途径关键分子为重点，探讨其与抗病的相关性。

以合作小型猪为模型动物，先后成功克隆、表达和分析了猪TLR2[44,45]、TLR3[46]、TLR7/TLR8[47,48]、TLR9[49]以及接头分子MyD88基因[50]等，明确了其分子遗传演化关系，揭示了其与天然免疫的关系；同时克隆、表达和分析了猪cGAS、RIG-I、DHX15、DHX16等受体的分子结构特征与模式识别抗病毒作用[51]，为模式识别天然免疫分子机制研究以及免疫佐剂、抗病毒药物的研发提供了依据。

3.3 在猪获得性免疫相关分子MHC中的研究应用

动物机体识别自我、排除非己成分以维持其正常生理活动和抵抗疾病的能力，与其主要组织相容性复合体（MHC）密切相关，其不仅控制着机体移植排斥反应，还参与机体对内（外）源性抗原的识别、结合，与机体获得性免疫应答有关。MHC分子在猪称为SLA，其中经典的SLAⅠ类和SLAⅡ类分子是其免疫相关的最重要的分子家族[52]。

以合作小型猪为研究对象，系统克隆和分析了猪MHCⅠ类/Ⅱ类分子中的SLA-1、SLA-2、SLA-3以及DRA/DRB、DQA/DQB的基因组13个（SLAⅠ类分子GenBank登录号为FJ905829～FJ905834，SLAⅡ类分子为FJ905835～FJ905840）和功能基因14个（SLAⅠ类分子GenBank登录号为FJ905817～FJ905822，SLAⅡ类分子为FJ905823～FJ905828），证实合作小型猪SLAⅠ类分子的基因组均由8个外显子和7个内含子组成；而SLAⅡ类分子α、β链的外显子和内含子组成有差异，其中DRA和DQA由4个外显子和3个内含子组成，DQB由5个外显子和4个内含子组成，DRB则由6个外显子和5个内含子组成，明确了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因组的组成结构[53,54]。

通过系统分析合作猪SLAⅠ类基因结构，发现SLAⅠ类分子基因可分为5个功能区，其多态性位点主要集中在α1与α2结构域，具有较多的单一核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP），其中核苷酸非同义置换位点数多于同义置换位点数。SLAⅠ类分子基因共有14个新的SNPs位点，其中SLA-2有7个，主要位于α2功能区；SLA-3有7个，主要位于α2和α3功能区。系统分析合作猪SLAⅡ类基因的结构及其多态性，发现SLAⅡ类分子基因共有3个新的SNPs位点，其中DQB有2个位点，主要位于β1区，DRB有1个位点，主要位于β1区。这基本明确了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子功能基因的多态性和遗传特征，针对这些遗传特点重点分析了合作小型猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子与抗原多肽、TCR、CD4/CD8结合部位的结构与特征，揭示了合作小型猪SLA分子与抗原多肽、TCR及CD4/CD8多分子识别结合的特异性和复杂性[55,56]。

3.4 在猪获得性免疫相关分子TCR中的研究应用

T细胞受体（T cell receptor，TCR）在机体获得性细胞免疫过程中发挥着重要作用，但由于该基因的遗传多样性及结构复杂性，基于病毒感染或免疫特异的猪αβT细胞克隆化增殖研究在国际上尚属空白[57,58]。

以合作小型猪为研究对象，开展了猪TCR分子基因结构与复杂性研究，系统克隆和分析了TCRα基因108个[59]、TCRβ基因98个[60]、TCRγ基因15个和TCRδ链基因5个，共计226个功能分子基因，初步建立了“健康”猪αβTCR和γδTCR T细胞TCR基因库。序列分析表明，猪α、β、γ、δ4种TCR亚基链都含有信号肽区、V区、D/J区和C区基因片段，但其亚基链间以及同一亚基基因序列组成都有所不同，这验证了T细胞激活后能产生胚系发育和基因重排现象，证实了TCR基因的胚系发育、基因重排规律与其分子结构多样性的相关性。

用建立的猪CD8+、CD4+T细胞亚群TCR CDR3（complementary determining region 3，CDR3）区基因谱型分析技术，研究了临床健康猪TCRα、β链CDR3的谱型种类和多样性，发现大部分αβTCR家族中表达20个TRAV家族和TRBV家族。此外，其CDR3的谱型呈类高斯分布状态，大多数含8种或更多长度不同的CDR3片段；同一个体不同的TRV家族CDR3出现频率变化较大，但同一TRV家族不同个体的频次并不完全相同。这些结果与αβT细胞的胚系发育、基因重排分子机制以及多样性特征相一致[57,58]。

通过分析猪瘟C株疫苗毒感染特异的T细胞αβTCR表达规律及其结构特征，明确了免疫后猪CD4+和CD8+T细胞TCRα链和β链的多样性与克隆化动态规律，明晰了二次免疫后呈现克隆性扩增的TRAV和TRBV家族CDR3序列结构特征，为猪瘟病毒抗原免疫机制研究提供了依据[23]。

克隆化的αβTCR家族CDR3区及全长基因的测序分析结果显示，αβTCR家族的CDR3区含有经典的分子结构特征，如TRBV CDR3区存在保守的P-A-V氨基酸基序，TRAV CDR3区也具有保守的D-D-Y氨基酸基序，且CDR3区序列相同的基因表达频率更高，可达50%以上。其次，克隆化αβTCR相同CDR3区的全长基因成员间的核苷酸序列相似度超过99%，表明这些克隆化αβTCR家族CDR3区的保守氨基酸基序有可能参与了猪瘟病毒特异抗原肽的识别和结合，为猪瘟多肽疫苗高通量筛选和开发提供了理论和技术依据[61]。

3.5 在猪疫苗免疫佐剂创制中的研究应用

免疫佐剂是动物疫苗的主要组成部分，在增强疫苗抗原免疫原性和免疫保护效果方面发挥着多种作用。细胞因子是机体细胞分泌的一类具有高免疫刺激活性和调节作用的多功能小分子，可通过天然免疫和获得性免疫的不同途径与机制发挥免疫佐剂的效应[62][19]。通过利用克隆表达的细胞因子或合成的CpG基序，以及构建的重组质粒及其组合作为猪用疫苗免疫佐剂，以培育的合作小型猪等为动物模型，开展了大量的免疫增强试验研究，证实重组IL-4、IFN-γ、CpG DNA及其组合均能发挥免疫佐剂增强效应[13-21]，先后获授权发明专利5项，通过转化应用获得5项省部级科技奖相关研究成果。

4 结论

本研究成功近交培育了合作小型猪4个近交家系和3个封闭群，证实其体型小的特性主要由遗传基因控制，而非营养、气候环境因素决定；合作小型猪群体内等位基因数目少、重复次数高和遗传稳定，与其他猪群体间的亲缘关系远，是一群比较理想的、独特的高原型近交群体；合作小型猪抗病免疫关键分子具有多态性和多样性，表明其具有适应各种恶劣的自然环境和复杂的病原微生物环境的抗病遗传能力，这种遗传特性适用于研究复杂的生命科学现象与机制，可满足兽医学、医学和生物学对高原型动物模型研究和应用的需要。