Nrf2 在中医药治疗脑缺血中的研究进展

2021-03-27丁子惠

吉林中医药 2021年5期

李奕，丁子惠，袁月，李萍

（长春中医药大学基础医学院，长春 130117）

卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一[1]。每年约795 000 人新发或复发卒中，其中缺血性卒中占比87%[2]。1996 年起，重组纤溶酶原激活剂（rt-PA）结合手术取栓成为缺血性卒中的治疗方案[3]，但存在治疗时间窗、rt-PA 潜在不良反应及其特定适应证等应用局限[4]。靶向缺血级联反应的重要细胞组分治疗脑缺血是新的研究方向之一[5]，核因子E2 相关因子2（Nrf2）作为抗氧化反应表达的重要转录因子，已成为预防和逆转卒中潜在的靶向治疗途径[6]。多项研究表明，中医药治疗方法通过调控Nrf2 防治脑缺血。

1 Nrf2 的生物学基础

转录因子Nrf2 是细胞和组织内源和外源性应激防御机制的主要调节因子，自1994 年发现以来，在结构、分子机制、功能、调节、下游途径及其作为疾病治疗靶点的意义方面得到了广泛研究。

1.1 Nrf2 的分子结构核因子E2 相关因子2（Nrf2）是外源性激活受体（XAR）的主要调节因子，调控参与细胞抵御外源性物质和细胞应激的靶基因表达。Nrf2 包含7 个具有碱性亮氨酸拉链蛋白（CNC）同源性的功能结构域：Neh1-Neh7（Nrf2-ECH homology），负责协同调控转录活性。保守结构域Neh1，含有3 个碱性亮氨酸基序（bZip），使Nrf2 得以识别、结合抗氧化反应元件（ARE）。在Nrf2 与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）解离后，Neh1 能够标记出Nrf2 移位的核定位信号。此外，Neh1 还与E2 泛素偶联酶共同维持Nrf2 的稳定性[7]。Neh2 位于氨基端，是Keap1 与Nrf2 的结合区，参与Nrf2 泛素化和蛋白酶体降解，对Nrf2 起到负性调控作用。Neh3 位于羟基端，负责调控ARE 相关基因的转录激活，Neh4 和Neh5 则通过与转录共激活因子CBP（CREBBP-cAMP 反应元件结合蛋白）相互作用启动Nrf2 下游基因转录，并关联核辅因子RAC3/AIB1/SRC-3 以增强Nrf2-ARE 相关的基因表达[8]。Neh6 和Neh7 均为Nrf2 转录活性的负调控因子，其中，Neh6 基于E3 泛素连接酶β-tRCP 的识别，建立Keap1 替代降解途径，Neh7 则通过与维甲酸X 受体α（RXRα）结合抑制Nrf2 转录活性[9]。

1.2 Nrf2 的抗氧化调控机制氧化应激（oxidative stress，OS）是多种病理过程的主要标志之一，是由过氧化氢、超氧化物和羟基自由基等活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的氧化还原失衡状态。这些高活性化合物导致脂质过氧化、蛋白质主链断裂、线粒体去极化和细胞凋亡，引起细胞和组织损伤，对包括大脑在内的组织和器官造成严重损害，是脑血管疾病发生发展的主要前驱因素[10]。

Nrf2 作为细胞抗氧化的重要转录因子[11]，在正常生理条件下，与Keap1 在ETGE 和DLG 基序处结合，维持连续泛素化和蛋白酶体降解。在应激状态下，Nrf2 脱离蛋白酶体的降解机制，DLG 基序从KEAP1中的DGR 域释放，在胞浆聚集并移位至核内与小Maf蛋白（MafF，MafG 和MafK）形成二聚体。靶基因启动子中的ARE 序列TGCnnn（G/C）Tca（T/C）与异源二聚体结合并激活相关表达，从而转录下游基因。Nrf2 常见下游基因产物包括抗氧化酶，如血红素加氧酶1（HMOX-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、过氧化物氧化还蛋白（PRDX）-1、谷胱甘肽还原酶（GR）；解毒代谢酶NAD（P）H 醌脱氢酶1（NQO1）、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）等[12]。此外，下游其他参与蛋白质转运、泛素化、磷酸化、细胞周期、增殖与凋亡的基因类别，也已被证明为潜在的Nrf2 调节内源性可编码基因。在维持细胞的氧化还原稳态中起着基本作用，并涉及细胞解毒、抗炎、NADPH 再生和中间代谢等多种细胞保护功能。

2 Nrf2 在中医药治疗脑缺血中的作用机制

缺血性卒中是由于血管破裂或堵塞，导致局部血液供应突然中断，并在相应脑组织中启动缺氧和低血糖状态。神经细胞膜去极化导致N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）的激活剂谷氨酸释放，这些非选择性阳离子通道的开放造成钙超载及神经细胞死亡，线粒体产生过多氧化物，进而阻碍抗氧化防御，导致缺血后炎症和脑组织损伤增加[13]。此外，由于血流恢复，还会发生血管壁结构蛋白降解和血脑屏障障碍，进一步增强组织氧合，生成ROS，加剧炎症反应、神经细胞凋亡和OS 损伤[11]。研究表明，Nrf2 可通过抗氧化应激、抑制炎症损伤、调节自噬以及促血管生成等作用机制减轻缺血后继发性脑损伤。

2.1 抗氧化应激脑缺血期间，过度的氧化刺激使Nrf2 从Keap1 中解离，并转移至细胞核与ARE 结合，激活下游抗氧化酶等细胞保护蛋白的靶基因表达。WANG J 等[14]利用局灶性脑缺血（MCAO）实验，发现MCAO 后24 h，小鼠缺血皮层Nrf2、HO-1 和SOD 抗氧化酶的蛋白表达水平增高；3 d 后，HO-1，NQO1，SOD2 和GPx 蛋白表达增至1.8～3.6 倍。其中，假手术组Nrf2 和HO-1 阳性细胞检测含量较少，表明Nrf2 和HO-1 在非缺血性皮层区域表达较低，在缺血区域显著增加。王力波等[15]构建Nrf2 敲除PC12细胞系，证实Nrf2 在脑缺血后的氧化应激过程中起抑制作用。胡跃强等[16]通过线栓法制备MCAO 模型，提示清热化瘀方可通过调控Nrf2/ARE 通路发挥抗氧化作用。赵秋阳等[17]对CIRI 模型大鼠进行百会、四神聪针刺治疗，缺血脑组织中Nrf2 表达水平显著升高，说明针刺可通过调控Nrf2 提高SOD、GSH-px 含量，从而治疗CIRI。更多研究表明，在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均检测到Nrf2 和HO-1，表明抗氧化物在大多数皮层细胞中可同时表达。通过中医药干预控制活性氧水平和预防氧化应激是解决缺血后继发性脑损伤和改善卒中预后的潜在治疗策略[14-17]。

2.2 抗炎症损伤炎症是由损伤引发的宿主防御机制，在缺血性脑损伤的发病机制中起着重要作用。脑缺血性损伤和血流再灌注会引起炎症级联反应，包括氧化应激、兴奋性毒性和炎症细胞浸润，进一步导致神经组织损伤和细胞凋亡[18]。缺血后神经系统炎症为卒中治疗提供了新的方向。彭啸宇[19]研究表明，山药多糖通过激活Nrf2/HO-1 通路进而降低TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，抑制炎性表达。研究发现，上调Nrf2/HO-1 表达可减轻炎症反应，通过中医药干预可抑制神经组织炎症反应，在脑缺血中发挥神经保护作用。HOU Y等[20]认为，Nrf2 通过作用于硫氧还蛋白-1（Trx1）/硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）复合物下调NLRP3 炎症小体活性，证明NLRP3 在脑缺血再灌注的炎症反应中起关键作用。朱慧渊等[21]建立改良MCAO 模型，发现脑组织中Nrf2 及炎症因子IL-1β 蛋白及Mrna 表达升高，丹参红花配伍能够通过调控Nrf2，减轻神经细胞凋亡，从而抑制相关炎症反应。而NLRP3 炎症小体参与胶质细胞介导的神经系统炎症，激活胞浆内模式识别受体与半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），进一步影响其他炎症介质的分泌[20]。

2.3 调节自噬自噬是指细胞对自身胞质蛋白或细胞器的吞噬作用，通过形成自噬小体，包裹部分胞内物质与溶酶体结合形成自噬溶酶体，继而将内容物降解。自噬是真核细胞降解长半衰期蛋白和受损细胞器的主要调节代谢机制[22]。在饥饿、缺氧、营养缺乏和感染等应激条件下，自噬可以被激活，为细胞提供营养和能量。此外，自噬还可以去除受损的细胞内细胞器和异常折叠的蛋白质。研究发现自噬在心血管疾病、神经退行性疾病、感染和免疫中发挥作用，可能是治疗这些疾病的靶点。自噬对缺血性中风有双向作用，通过调节自噬可以减轻脑缺血损伤。选择性自噬接头蛋白p62 在氧化应激下，通过与Keap 1 相互作用激活Nrf2，介导自噬。此外，Nrf2 与ARE 序列结合，增强p62 蛋白的表达，从而形成p62 和Nrf2 之间的正反馈回路[23]。PRASAD S等[24]在短暂性中动脉闭塞（tMCAO）模型中发现，自噬受体蛋白p62 和Nrf2-EpRE 信号通路的保护作用抑制了大鼠脑缺血时的OS 损伤，并增强了Nrf2 活性，减少大鼠脑梗死体积，减轻缺血后神经认知功能障碍。通过使用Nrf2 激活剂可以提高神经细胞活性，降低血脑屏障通透性，并激活细胞保护基因转录。

2.4 血管生成血管生成是由已有的血管发展形成新的毛细血管，在缺血性卒中后的组织重塑过程中起着重要作用。微循环功能的重建能够促进脑卒中的恢复，加强血运重建是卒中的治疗前景之一[25]。氧化应激通过转录因子调节血管生成，在脑缺血性疾病中起着抑制修复性血管生成的作用。Nrf2/HO-1 参与血管生成的调控过程，HO-1 对血管原损伤具有保护作用，过表达 HO-1 可激活 VEGF 生成。Nrf2 参与调控缺血区血管生成，保护内皮表型，维持脑血管的功能完整性，并通过血管生成的重要调节因子，血管内皮生长因子（VEGF）发挥作用[26]。任丹君[25]采用MCAO 模型，研究发现脑缺血后血管新生内皮细胞增加，大鼠脑梗死区域 VEGF、VEGFR2 表达升高，证实诃子组分可通过血管生成发挥神经保护作用。刘文星[27]通过体内外研究发现TCE 可通过激活Nrf2/HO-1 上调 CD31、VEGF 表达，发挥抗氧化作用，进而促使血管新生，保护脑部功能。解燕昭[28]发现实验性脑梗死后，应用益母草碱可促进 Nrf2 核转位，激活 Nrf2 信号通路及其下游HO-1 表达，增加促血管生长因子VEGF 表达。而Nrf2-/-小鼠中的VEGF 表达未见增加，提示中药有效成分通过激活Nrf2 及其下游HO-1，进一步上调VEGF 表达促进血管生成。

3 靶向Nrf2 治疗脑缺血药物进展

3.1 人参皂苷人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是使用最广泛的中草药之一，属于五加（Araliaceae）科Panax属。药理研究表明，从人参中提取的有效成分人参总皂苷，包括人参皂苷Rg1、Rb2、Re、Rd 等40 余种活性单体，具有抗炎、抗氧化和神经元凋亡抑制等药理活性，在神经保护方面具有一定的研究前景。人参皂苷Rg1 在脑缺血损伤中发挥显著神经保护的主要机制与抗氧化和抑制细胞凋亡密切相关。研究证实，人参皂苷Rg1可减轻OGD 诱导的氧化应激，通过下调细胞质中的Nrf2 水平，上调细胞核中的Nrf2 表达，提升HO-1 的mRNA 和蛋白水平及核转移速度，从而在模型动物和细胞中调控Nrf2/HO-1 与PPARγ/HO-1 表达水平[29]。人参预处理有助于改善神经功能缺损，防止病灶体积急剧增大，抑制星形胶质细胞，激活野生组小鼠Nrf2靶标抗氧化蛋白[16]。人参皂苷治疗组Nrf2、HO-1、SOD 较模型组增加，MDA 降低，提示人参通过Nrf2途径激活脑缺血后的神经保护作用[30]。

3.2 银杏内酯银杏内酯为银杏叶的内酯类活性成分，张雯等[31]在研究中通过激活Nrf2/ HO-1 通路以验证其神经保护功效，结果显示在tMCAO 后7 d，对照组小鼠脑梗死体积下降，脑水肿和神经功能缺损减轻，急性胶质细胞活化抑制，Nrf2-/-组则相反，表明银杏内酯作用过程中的Nrf2 依赖性。银杏内酯A 还可作为免疫调节剂，有效减少中性粒细胞和T 细胞浸润，降低梗死区域中活化小胶质细胞和巨噬细胞的数量[32]，并通过防止内皮间连接破坏，控制脑含水量，稳定血脑屏障（BBB）[31]。CLAUSEN B H 等[33]研究发现，银杏内酯通过抗炎细胞因子IL-10 和IL-12p70 减轻急性脑损伤引起的脑水肿和神经功能缺损，进一步证实了MMF 的神经保护作用。

3.3 丹参酮IIA 丹参酮IIA（TSA）是从中药丹参中提取的脂溶性菲醌化合物。通过TSA 预处理激活Nrf2，可在MCAO 后的24 h 至1 个月内减少皮质损伤和感知运动障碍。研究表明，TSA 对Nrf2 的激活显著降低了胞质硫氧还蛋白互作蛋白、NLRP3 炎性小体及下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18 的表达，发挥Nrf2介导的神经保护作用[17]。

3.4 川芎嗪川芎嗪（TMP）是川芎的主要成分之一，用于治疗中风等心脑血管和神经疾病。TMP 可清除脑组织损伤所增加的自由基，缓解病理改变，并通过脑部水肿的减轻，改善脑部神经功能[34]。研究发现TMP通过激活Nrf2/HO1 通路减轻缺血后脑损伤，降低炎症因子[35]和中性粒细胞[36]。川芎与冰片合用可减少钙超载，减轻超微结构变化、神经元凋亡，并增加γ-氨基丁酸(GABA)及下丘脑甘氨酸（Gly）含量，在缓解神经元兴奋毒性损伤，钙超载和超微结构异常方面具有协同作用[37]。

3.5 姜黄素姜黄素（Curcumin）是从姜科、天南星科根茎中提取的酚类色素，能够透过血脑屏障将姜黄素的细胞保护作用扩展至中枢神经系统，已被证明可减轻多种中枢神经系统疾病，包括神经退行性疾病、脑缺血、脑出血和脑外伤[38]。其神经保护作用的发挥与Nrf2、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活化相关。姜黄素已被证明可通过Akt/ Nrf2 通路减少tMCAO 大鼠的脑梗死体积，减轻神经功能障碍并降低氧化应激水平[39]。体外研究表明，姜黄素可减少小胶质细胞迁移，从而触发具有抗炎和神经保护特性的细胞表型[40]。

除上述中药有效成分外，还有许多天然产物，合成化合物和临床药物，例如：银杏、丹皮酚、异槲皮素、熊果酸、异鼠李素HP-1c、天麻素、双环醇、重组人促红细胞生成素和omega-3 脂肪酸等，通过Nrf2 减轻缺血性脑损伤。