MC3T3-E1细胞在不同机械应力刺激下成骨表达机制的研究进展

宋志靖 王薇* 宋敏* 董万涛 巩彦龙 王凯 范凯 张亚彬

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000 2.甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州730000

机械应力是刺激骨组织生长的有效条件，就如Wolff 定律指出的一样，是生物体内的一种生理刺激的需要。缺乏机械应力刺激的生物体，其维持骨重建与动态平衡机制将出现偏离，最终形成骨质疏松。骨细胞存在于骨基质中，感知机械载荷的变化，并通过成骨细胞产生改变骨形成的信号。成骨样细胞系MC3T3-E1细胞作为力学刺激敏感细胞，是研究骨生长、发育、成形机制的基本单位，也是研究应力学环境下成骨机制的经典细胞。目前，对离体MC3T3-E1细胞有多种机械应力刺激方式:持续静压力、流体剪切力、震荡流体剪力、张应变(单/双向拉伸牵拉应力)、机械离心力、高重力(超重)、微重力(失重)、强磁重力环境等，这些不同方式的机械应力刺激影响着MC3T3-E1细胞的成骨表达过程。

1 持续静压力

流体单位面积所受到的垂直于该表面上的力称为流体的静压强，也称静压力，持续作用一定时长称为持续静压力(continuously compressive pressure,CCP)。研究显示，给MC3T3-E1细胞加1 atm持续静压力，细胞Clcn3mRNA表达显著上升，表明成骨细胞CLC-3氯通道对压力刺激敏感[1]，周期性动态压力可促进CLC-3表达,增加细胞膜表面CLC-3离子通道的数量[2]。将MC3T3-E1成骨样细胞分别施加50、100、150 kPa的持续静压力1 h，再分别培养24、48 h后，细胞表面ADAM家族中金属蛋白酶解离素28(ADAM28)的表达明显减弱，表明在骨改建过程中，ADAM28与成骨细胞活性、增殖关系密切[3]。给MC3T3-E1细胞施加2 atm的CCP，观察不同时间细胞TD、ALP、OCN的变化，说明持续性静压力可能促进成骨细胞分化成熟，加速骨基质的钙化[4]。研究[5]显示，在CCP刺激下，MC3T3-E1细胞的骨形态发生蛋白(BMPs)信号通路与多种骨代谢过程有关，主要通过典型的Smad蛋白依赖性途径(TGF-β/BMP配体、受体和Smad蛋白)和非典型Smad独立信号通路(MAPK信号转导TGF-β/BMPs的p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路)发挥作用。前者在成骨作用方面不可或缺，后者直接影响细胞骨架的力学转导与细胞骨架重构和聚合。

2 流体剪切力

压缩、拉伸、剪切力导致的组织变形使组织液在细胞周围运动，这种组织液的移动诱导出流体切应力,又叫流体剪切力(fluid shear stress，FSS)。它广泛存在于骨骼微循环中，促进成骨机制[6]。研究[7]显示，ERK5信号通路调控FSS对MC3T3-E1细胞 MMPs、TIMPs蛋白的表达，能够显著地促进OPGmRNA表达,降低RANKLmRNA表达[8]，也可增强BMP2、BMP7mRNA的表达，并通过ER-α-ERK5信号通路上调CDK4和Cyclin D1，从而使MC3T3-E1细胞增殖[9]。同时，FSS激活ERK5-AKT-FoxO3a信号通路，抑制caspase-3的激活，起到保护成骨细胞凋亡的作用[10]。除ERK5信号通路外，通过基因芯片分析发现[11]，FSS涉及的信号通路还主要包括Notch信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。还涉及前列腺素的生物合成、NO的信号传导、钙介导的信号及细胞免疫反应等不同的功能分类。在流体剪切力的作用下，MC3T3-E1细胞骨架进行重构，F-actin蛋白向一个方向排列，并且更加紧密。同持续性流体剪切相比，间歇(周期)性流体剪切力(cyclic fluid shear stress，cFSS)和震荡流体剪切力(oscillatory shear stress，OSS)能有效促进成骨细胞分化，二者通过ERK5信号通路在诱导成骨细胞增殖中发挥的作用，CyclinD1是ERK5信号通路下游的重要靶点基因[12]。此外，雌激素(比如17β-雌二醇)、BMP2和整合素β1通路交互调控与FSS对成骨细胞的分化和增殖具有协同作用[13-15]。而且，Piezo1离子通道是一个机械敏感的离子通道，成骨细胞通过它感知和响应机械载荷的变化，是液体剪切应力引起的基因表达变化所必需的[16-17]。但也有研究[18]显示，超过1 h的FSS刺激会对MC3T3-E1细胞造成损伤。所以，FSS刺激量和作用时间对细胞造成的损伤机制有待进一步揭示。

3 张应变

每一种应力作用在物体都可产生相对应的应变，张应力(单/双向拉伸牵拉应力)作用前后物体长度、形状及体积变化之比称为张应变(tensile strain)。被称为矫形外科米开朗基罗的Ilizarov教授[19]在上世纪五六十年代成功地应用牵拉应力刺激骨形成，奠定了牵张应力下骨形成的理论，即“牵张成骨”理论。此后，该理论广泛应用在骨科临床中，临床疗效确切。但其成骨机制在微观领域的研究还需深入。有研究者[20]作了初步探索，在特定周期性牵拉应力作用下，促进三维培养的MC3T3-E1细胞增殖和OPN mRNA的合成，抑制ALP活性，机械张应变增加了IGF-1和PGE2的分泌，提高了OPG、(IL)-6表达和NOS活性，从而增强成骨细胞的分化能力,周期性循环拉伸可显著提高成骨胶原合成。但是，细菌炎症可抑制拉伸应变诱导的成骨细胞中Runx2/Cbfalpha1的表达，上调c-fos的表达,降低成骨细胞在持续的拉伸应力下恢复成骨的能力[21-22]。在信号通路中，Wnt信号转导通路在调控成骨细胞成骨作用中发挥着重要作用[23]，分别采用3 %、6 %、12 %形变幅度的正弦波对MC3T3-E1细胞进行牵张应力干预，不同时间节点干预后，可上调Wnt信号转导通路，促进细胞成骨分化。亦可增强ALP 活性，影响Wnt1、Runx2、OC、Osterix、β-catenin mRNA 表达升高，而 DKK-1 mRNA 表达下降[24]。

4 机械离心力

机械离心力(centrifugation)是一种虚拟力，是一种惯性的体现，是物体在做圆周运动时所产生的一种离心运动现象。在机械加载作用下，它使旋转的物体远离它的旋转中心。研究显示[25-27]，机械离心力刺激显著增加了MC3T3-E1细胞中Peiostin (OSF-2) semaphorin-3AmRNA的表达。同时，对力学靶点Runx2响应显著，Runx2/Cbfa1蛋白及基因都是力学刺激的关键目标，是BMP信号成骨特异性基因表达，是力学刺激在成骨细胞内作用的终极靶点，在机械离心力刺激的过程中BMP的全程参与，在力学信号转化为化学信号的细胞内信息传递级联反应这一过程中的作用不可或缺。同时，机械离心力载荷诱导的c-fos表达主要依赖于cAMP，而非PKC[28]。有研究者[29]应用离心结合热诱导相分离技术，制备了MC3T3-E1细胞附着的纳米纤维管状聚(l -乳酸)(PLLA)支架，具有显著的骨组织再生潜力，在材料科学和组织工程方面进行新的探索。

5 重力

物体由于地球的吸引而受到的力称为重力(gravity)。对成骨细胞 MC3T3-E1的影响包括高重力(超重)、微重力(失重)、强磁重力。

高重力(hypergravity)也称超重，是指物体对支持物的压力大于物体所受重力的现象。它可引起成骨细胞骨架结构重排和细胞形态改变。成骨细胞 MC3T3-E1可响应高重力，细胞骨架高度与有序性降低，排列松散，微丝肌动蛋白束状结构呈现弥散状，细胞变扁，细胞表面积明显增大。高重力可有效促进成骨细胞成熟分化，且较高水平(10、15、20 g) 高重力的促进作用更显著[30-31]。

微重力(microgravity)也称失重，是指物体对支持物的压力小于物体所受重力的现象。在微重力环境下机体能感受到的表观重量远小于实际重量。该环境下可导致骨量丢失，肌肉松弛，形成骨质疏松。研究[32]显示，微重力影响细胞外基质、细胞因子及其受体和丝裂原活化蛋白激酶，并诱导细胞骨架微丝解聚，可以调控 NO/NOS 系统而影响信号传导。通过抑制 AK的磷酸化形式抑制前成骨细胞的增殖[33]。但在微重力环境下，亦可激活相关成骨机制，又促进成骨。在微重力环境中，MC3T3-E1细胞的ALP、OCN、CoL-Ⅰ的基因和蛋白水平表达下调，同时激活NF-κB信号通路促进成骨表达[34]。也有研究[35-36]从药物防护角度进行了干预，在SMG条件下，奥金肽(osgentide，OST)、成骨生长肽(OGP10-14)能够促进MC3T3-E1细胞的增殖并保护其成骨机制，为研究微重力下防治骨丢失提供了理论依据。

强磁重力环境(high magneto-gravitational environment,HMGE)是大梯度强磁场与重力产生的复合人工物理环境，该环境下对细胞结构与功能产生系统性影响。研究[37]显示,7 d矿化阶段的MC3T3-E1细胞对HMGE更敏感,磁场促进成骨细胞的分化，还增加胞内游离钙离子浓度。然而，HMGE对MC3T3-E1细胞的形态及增殖影响不明显，但在强磁失重环境中抑制MG63细胞CaM/CaMKⅡ信号[38]和钠、镁、钙等元素的相对百分含量[39]。说明同为成骨细胞的不同细胞株对该环境反应不同，揭示成骨细胞功能的多样性，及对外界应力应变的差异性。

6 小结与展望

机械应力的加载和卸载可以影响成骨细胞的成骨机制进程和功能。研究显示，MC3T3-E1细胞对机械应力信号的转导通过Piezo1和Trpv4、Ca2+通道、ClC-3氯通道、胞外基质-整合素-细胞骨架结构系统、细胞调控因子等多种途径入核作用于靶基因，并调控相应基因表达调控相应力学刺激信号转导为化学信号，通过化学感受器调控细胞膜、细胞内及细胞核的各类感受器进行成骨，这种细胞对力学刺激的接收、传导构成了一个复杂的力学信息响应网络。同时，成骨细胞的细胞骨架在不同应力信息网络传输过程中起到了重要而显著的作用[40]，MC3T3-E1细胞的肌动蛋白骨架具有识别细胞状态和调节细胞外基质矿化、骨形成的功能，是成骨细胞的机械传感器[41]。MC3T3-E1细胞由外及内的力学刺激与转导是其内在微环境中一个不可或缺的重要生理因素，细胞骨架作为机械应力转化为化学刺激信号的前哨，是感受和转导力学信号的重要环节。

不同力学刺激机信号的转导有不同的调控方式，寻找机械应力刺激对骨骼重建与保持其稳定活力的机制和契合点、准确把握机体对机械应力刺激的强度、持续时间、循环周期等生理需求，改善骨骼微环境、促进骨骼代谢意义重大。研究成骨细胞株MC3T3-E1细胞不同形式力学刺激对细胞的影响机制以及应力刺激下的药物干预机制，有助于阐释临床骨折愈合、骨骼功能健康、骨病发生等方面机制，通过细胞微观研究为临床宏观应用药物防治骨科疾病提供理论基础和物质基础。未来，不同力学刺激下MC3T3-E1细胞成骨机制的研究将进一步深入，同时，也为药物干预不同应力环境中成骨细胞成骨机制和细胞修复研究打开了空间。