R-spondins调控WNT/β-catenin信号通路的机制及其对骨骼系统的影响

陈明洲 李朝旭 贵鹏 刘继鸿 王龙 徐渠

1.桂林医学院研究生学院，广西 桂林 541004 2.广西壮族自治区南溪山医院创伤手外科，广西 桂林 541002

R-spondins由2002年发现于10～12 d小鼠胚胎顶板和神经上皮表达的R-spondin 1及之后发现R-spondin 2、R-spondin 3、R-spondin 4组成，对R-spondin家族的作用一直存在着争议。随着R-spondin家族受体LGR 4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs和IQGAP1的发现，R-spondins增强WNT/β-catenin信号通路在胚胎发育、器官稳定、干细胞自我更新中的作用被予以证实。近来研究发现R-spondins通过WNT/β-catenin信号通路调控骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞参与胚胎骨发育、成体骨形成和骨关节疾病的发生发展，对R-spondins的研究可能成为骨代谢疾病新的治疗方向。本文将对R-spondins增强WNT/β-catenin信号通路的相关机制及其对胚胎骨发育、成体骨形成、骨质疏松和骨关节炎的影响做一综述。

1 WNT/β-catenin信号通路

WNT信号通路是指富含半胱氨酸的分泌糖蛋白WNTs家族与受体结合进而激活一系列细胞内级联反应的重要细胞通路[1]。WNT信号通路能协调多细胞生物胚胎发育、维持成体组织器官稳定，而异常的WNT信号通路与多种遗传性疾病、代谢性疾病、肿瘤等疾病密切相关[2-3]。WNT信号通路分为依赖β-catenin的WNT/β-catenin信号通路(又称经典WNT 通路)和不依赖β-catenin的非经典 WNT通路。相比于WNT/β-catenin信号通路，非经典通路更加复杂。主要包括WNT/PCP(planner cell polarity)通路、WNT/Ca2+通路和其他非β-catenin/TCF依赖的通路[4-5]。

在WNT/β-catenin信号通路中，对β-catenin的调控处于中心地位。腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatosis polyposis coli，APC)、骨架蛋白(axin)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK3(glycogen synzhase kinase 3)和CK1(casein kinase 1)、低密度脂蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LGP5/6)、T细胞因子(T-cell factor，TCF)转录因子均是WNT/β-catenin信号通路的重要成员。

当无WNTs刺激时，胞质内的“破坏复合物”(由APC/axin/GSK3和CK1组成)中的GSK3和CK1会磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin会被蛋白酶体降解，WNT/β-catenin信号通路随之关闭。当存在WNTs刺激时，WNTs与细胞膜上七次跨膜Frizzld受体和LRP5/6共受体同时结合，导致了“破坏复合物”解体，从而抑制β-catenin的降解，胞质内β-catenin增加，进而转移进入细胞核内与TCF转录因子结合，激活WNT/β-catenin信号通路[1-2]。

2 WNT/β-catenin信号通路调控蛋白R-spondins

2.1 R-spondins组成及结构特点

R- spondins是包含TSR-1结构域的超家族成员，包括R-spondin1、R-spondin 2、R-spondin 3和R-spondin 4四种分泌糖蛋白成员。这些蛋白的分子量大约为35 kDa，它们60 %的氨基酸序列和保守结构区域是相同的，四种R-spondin都含有三个相似的特殊保守结构域：氨基末端的两个富含半胱氨酸的Furin结构域、TSR-1结构域、羧基末端富含碱性氨基酸的结构域[6]。TSR-1结构域可能与蛋白多糖结合有关，两个Furin结构域则可分别与ZNRF3/RNF43、LGR4/5/6结合从而介导调控WNT/β-catenin信号通路[7]。

2.2 R-spondins增强WNT/β-catenin信号通路的相关机制

研究[8]发现LGR4/5/6是R-spondins的高亲和受体。ZNRF3/RNF43通过泛素化和后续的串联反应可降解WNT信号通路细胞表面Frizzld受体，发挥WNT信号通路的负反馈调节作用[9-10]。

Hao等[11]提出了R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信号传导单元调控WNT/β-catenin信号通路的机制。WNTs与LRP4/5/受体和Frizzld共受体同时结合通过WNT/β-catenin信号通路，使胞质内β-catenin增加，进而转移进入细胞核内与TCF转录因子作用，激活ZNRF3/RNF43基因表达ZNRF3/RNF43并转运至细胞膜上。当没有R-spondins存在时，细胞膜上的ZNRF3/RNF43通过胞质内的接头蛋白(dishevelled，DVL)识别Frizzld受体，诱导Frizzld受体泛素化和降解，从而抑制WNT/β-catenin信号通路。当R-spondins存在时，R-spondins与其受体LGR4/5和细胞膜ZNRF3/RNF43同时结合，诱导ZNRF3/RNF43泛素化和降解，进而阻断Frizzld受体泛素化和降解，增强WNT/β-catenin信号通路[8-11]。R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信号传导单元保证了WNT/β-catenin信号通路稳定，参与维持消化道干细胞的自我更新和分化，促进消化上皮损伤修复和腺体再生[12-14]。此外，在ZNRF3/RNF43降解的基础上，R-spondins-LGR4还可以通过招募IQGAP1来诱导LRP5/6磷酸化增强β-catenin活性，提高WNT/β-catenin信号通路调节细胞的黏附和迁移能力[15]。

目前已经有相关报道[16]发现R-spondin1-4在增强WNT/β-catenin信号中对LGRs有不同的需求，特别是R-spondin 2和R-spondin 3在没有LGRs的情况下也能够增强WNT/β-catenin信号通路。R-spondin 2/3可通过与HSPGs和ZNRF3/RNF43相互作用，诱导细胞膜表面ZNRF3/RNF43降解来增加Frizzld受体积累，增强WNT信号通路[17]。在敲除LGRs的体细胞中R-spondin 2和R-spondin 3仍可以增强WNT信号通路。在小鼠和爪蟾胚胎发生过程中，伴随着LGR4、LGR5和LGR6受体的丢失并不表现为R-spondin 2或R-spondin 3相关表型的丢失[18]。以上报道各自独立而又相互证明了R-spondin 2和R-spondin 3或许不需要LGR4/5/6参与，发挥抑制RNF43/ZNRF3增强WNT信号通路的分子机制。在病理情况下，由于R-spondins基因融合突变、转录因子异常激活，R-spondins通过上述机制中LGR 4/ 5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1相关因子参与乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、骨髓瘤等多种肿瘤的进程[19-23]。

3 R-spondins在骨骼发育和骨相关疾病中的作用

3.1 R-spondins对胚胎骨发育的影响

R-spondins广泛表达于小鼠颅面骨、四肢骨和躯干骨胚胎发育的各个时期[7]，R-spondin 2基因敲除小鼠观察到其下肢远端趾骨和腓骨、上肢远节指骨和桡骨丢失同时伴有腭裂和颅面畸形，有趣的是相似的骨骼发育缺陷也出现在干扰WNT/β-catenin信号通路的小鼠模型中，尽管R-spondin 3基因敲除小鼠无明显的骨骼异常，但在R-spondin 2和R-spondin 3双基因敲除的小鼠中检测到更严重的骨骼畸形，表明R-spondin 2和R-spondin 3在功能上有一定程度的重叠[24]。Szenker-Ravi等[18]通过对5组人类家庭的11个肢体畸形胎儿的研究发现，R-spondin 2基因突变的4个胎儿表现为桡骨、胫骨缺失伴或不伴肱骨、股骨发育不良，以及胚胎前轴侧手指缺失，其他7个胎儿表现为部分Tetra-amelia综合征(四肢完全缺失、肺发育不全、唇腭裂和唇腭沟发育不全)，这与敲除小鼠R-spondin 2基因畸形相似。另外人类手掌、足跖部分区域皮肤角化过度异常增厚与R-spondin1基因的突变相关，R-spondin 4基因错位与人类常染色体隐型疾病四肢指甲缺失高度相关[6]，这些过程最有可能通过激活WNT/β-catenin信号通路实现。

3.2 R-spondins对成体骨发育的影响

成骨细胞的成骨同破骨细胞的骨吸收之间保持平衡对成体骨的维持和重建至关重要，研究证实WNT/β-catenin信号通路影响成骨细胞和破骨细胞的生物学行为，在骨合成代谢方面具有重要作用[25]。Sharma等[26]发现在人类原代成骨细胞和人类成骨祖细胞系FOB 1.19细胞的分化过程中，R-spondin1表达增加。在FOB 1.19细胞中，敲除R-spondin 1导致碱性磷酸酶活性降低而转染R-spondin1，通过激活WNT/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化，提高碱性磷酸酶活性。相似的结果在小鼠成骨细胞模型MC3T3-E1细胞(成骨前细胞系)中也得到证实。这些结果证明R-spondin1可能通过自分泌的形式促进体外成骨细胞的成骨活性。

Zhu等[27]发现R-spondin 2-LGR4通过激活WNT/β-catenin信号通路，促进MC3T3-E1细胞(成骨前细胞系)的分化、成骨并能抑制破骨细胞的生成，而在小鼠OVX模型(雌激素缺乏导致进行性骨质疏松小鼠模型)体内试验中，外源性R-spondin 2改善了OVX小鼠胫骨近端的骨丢失和骨小梁结构，同时促进小鼠骨形成，增加骨质量。Knight等[28]则通过对R-spondin 2基因敲除导致肢体发育缺陷的小鼠模型以及构建完全敲除R-spondin 2基因的小鼠模型研究，发现R-spondin 2调节成骨细胞的生成和矿化，破坏R-spondin 2表达干扰骨骼矿物质沉积、骨骼形成，导致骨量减少和骨强度下降。另外破坏R-spondin 2小鼠特殊骨骼表型与干扰LGR5/6的WNT/β-catenin信号通路表型相似，对敲除R-spondin 2小鼠的分析也发现了WNT/β-catenin信号通路的抑制。

软骨细胞在软骨骨化过程中按静止软骨区域、增殖软骨细胞区域、软骨细胞成熟/肥大区域顺序分化，然后被成骨细胞取代。在增殖软骨区域的软骨细胞表达转录因子Sox 9，分泌II型胶原(collagen type II，CII)和蛋白聚糖(aggrecan，Acan)等基质蛋白[29]，成熟/肥大区域的软骨细胞则表达另一个转录因子Runx 2[30]。Takegami等[31]发现R-spondin 2基因敲除的小鼠模型中软骨细胞的β-catenin的含量减少，而Sox 9和CII的含量增加。通过对ATDC 5软骨细胞系R-spondin 2的过表达和敲除对比研究，发现R-spondin 2激活WNT/β-catenin信号通路抑制增殖软骨细胞Col2a1、Sox 9、Acan表达但不抑制成熟/肥大软骨细胞Runx 2表达。支持R-spondin 2激活软骨细胞WNT/β-catenin信号通路促进软骨内成骨过程中增殖软骨细胞向肥大软骨细胞分化。体内外试验均表明R-spondin 2是一种有效的骨代谢正向调控因子。

Moayyeri等[32]通过对人类足跟骨定量超声和足跟骨平片全基因组相关研究的荟萃分析发现，R-spondin 3基因与人类骨密度和骨折风险存在显著关联性，暗示R-spondin 3可能参与骨代谢。

3.3 R-spondins对骨代谢疾病的影响

废用性骨质疏松症是由于骨骼缺少机械刺激而导致骨量减少，普遍存在于骨折固定、神经肌肉疾病或脊髓损伤等长期患肢制动的患者中[33]。Shi等[34]发现R-spondin 1在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的过程中动态表达，R-spondin1-LGR4通过激活WNT/β-catenin信号通路增强骨髓间充质干细胞成骨分化和骨形成。在体外连续循环机械拉伸(continuous cyclic mechanical stretch，CMS)机械刺激下，R-spondin 1在小鼠骨髓间充质干细胞中表达增加，而在后肢悬吊(tail suspension，TS)机械刺激去除小鼠模型中R-spondin 1的表达下降。过表达R-spondin 1可显著改善TS小鼠的骨量丢失。R-spondin 1是一种机械刺激敏感蛋白，R-spondin 1-LGR4是潜在的防治废用性骨质疏松症的靶点。

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是以关节软骨的退行性变和关节周围继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，疼痛、功能障碍和畸形是其主要的临床表现[35]。Okura等[36]发现OA患者关节滑膜液中R-spondin 2含量随着OA的严重程度逐渐增加，米安色林可以通过抑制软骨细胞中R-spondin 2诱导的WNT/β-catenin信号通路，改善和预防内侧半月板失稳膝关节OA小鼠模型关节软骨的降解。巨噬细胞是单核细胞进入外周组织后分化而来重要免疫细胞，不同局部微环境刺激巨噬细胞可分化成为具有不同功能的表型(即极化)，包括M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞，它们在机体病原微生物与衰老细胞的清除、促进和抑制炎症反应、诱发适应性免疫反应及损伤组织的修复与重构都发挥重要作用[37]。Zhang等[38]发现在OA患者和胶原酶诱导的骨关节炎(collagenaseinduced osteoarthritis，CIOA)小鼠模型关节滑膜组织中，mTORC1信号的激活增强了M1型巨噬细胞极化同时减弱M2型巨噬细胞极化，进一步研究发现M1巨噬细胞通过分泌R-spondin 2，促进了关节软骨的退化、降解和骨赘生物的形成。诱导的OA在小鼠中的发展，证实M1巨噬细胞和R-spondin 2是OA治疗的潜在靶点。

4 结论与展望

随着LGR4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1的发现，R-spondins增强WNT/β-catenin信号通路的机制逐渐清晰。在骨骼系统中R-spondins在胚胎骨骼发育的各个阶段广泛表达，R-spondins不但与人类四肢骨骼发育畸形和缺失密切相关，而且能够通过增强WNT/β-catenin信号通路，促进增殖软骨细胞和成骨细胞分化、抑制破骨细胞的生成，有助于成体骨形成和维持骨密度，有力的证明了R-spondin家族是一种骨代谢正向调控因子。另外R-spondin 1、R-spondin 2参与废用性骨质疏松症、骨关节炎骨代谢疾病的发展，同时米安色林通过抑制R-spondin 2改善骨关节炎的进展，也显示出靶向R-spondins治疗骨丢失和骨关节炎等相关骨代谢疾病的潜力。

虽然R-spondins在骨组织中仍然有许多问题等待解决，包括R-spondin家族成员种类多样、功能影响复杂，对R-spondins调控WNT/β-catenin信号通路的机制和相关因子仍需做进一步研究。但是对于R-spondins应用于骨合成代谢相关疾病治疗的前景依然值得期待。