心肌细胞株的特性及其在心血管疾病研究中的应用*

田香勤 郭志坤

（新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室，新乡 453003）

成年大鼠心肌细胞体外培养环境要求较高，难以分离培养[1]。乳鼠的心肌细胞与成年大鼠相比在形态、结构和功能方面具有较大差异[2]，而且乳鼠出生后7 d心肌细胞便停止分裂和增殖[3]，难以进行体外传代培养，限制了其遗传操作。心肌细胞的原代分离和纯化技术较为复杂，细胞的提取需要以牺牲大量实验动物为代价。以上原因限制了原代心肌细胞在心血管疾病研究中的应用。近年来，多能干细胞诱导的心肌细胞（cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells，PSC-CMCs）逐渐成为心血管疾病研究的新模型[4]，但由于PSC-CMCs代价昂贵、耗时费力，并且存在诱导效率低和分化成熟度不均一等问题，在科研应用中亦受到一定限制[5]。

心肌细胞株由于其来源稳定，可重复性强，体外培养条件简单，并且能稳定传代，在心血管疾病研究中得到越来越广泛的应用。目前常用的心肌细胞株包括大鼠心肌H9C2细胞株、小鼠HL-1心房肌细胞系、成人心室肌AC16细胞株等，尽管以上心肌细胞株功能相近，但每一种细胞株都有其本身的特性及研究应用中的优缺点。现针对当前心肌细胞株的生物学特性及其应用进行综述，以拓展其在心血管疾病研究应用中的认识，从而为心血管疾病研究选择更好的细胞模型提供参考。

1 小鼠H9C2心肌细胞系

1.1 H9C2细胞的基本特性

H9C2细胞是20世纪70年代首个通过细胞连续传代建立的大鼠心衍生细胞。1976年，Kimes和Brandt从BD1X大鼠13 d胚胎心室组织的细胞克隆中获得了H9C2细胞株。尽管H9C2细胞未分化为成年心肌细胞，但已经基本具备心肌细胞的生理特性。H9C2细胞和原代大鼠心肌细胞表面被膜中存在类似的糖残基。在电刺激或用乙酰胆碱刺激作用下，H9C2细胞产生收缩并同时产生动作电位[6]，表现出向外整流的瞬时K+电流以及内向L型Ca2+通道电流的特性[7]。然而，H9C2在形态上具有骨骼肌的特性，细胞中无法观察到心特异性的形态学结构[8]。

1.2 H9C2细胞的适用性及其优缺点

由于H9C2细胞具有增殖分裂能力强、易于传代等特点，已经成为研究心肌细胞自噬、缺血缺氧，氧化应激、炎症、药物筛选以及药物毒性代谢的首选细胞[9]。利用原代分离大鼠心肌细胞与H9C2细胞同时作为研究体外心肌肥厚的模型，2种细胞表现出几乎相同的肥厚反应[10]。研究表明，H9C2细胞和原代分离心肌细胞在相同干预条件下的细胞关键基因功能改变基本一致[11]。

在心跨物种研究中，H9C2细胞亦是体外实验研究的首选。H9C2细胞在细胞毒性、氧化应激和兴奋-收缩耦联Ca2+瞬变等方面与斑马鱼的心肌细胞具有相似的特点[12-14]。另外，大鼠和斑马鱼的miR-1基因序列中，除了“种子序列”外，只有一个核苷酸的差异[15]。因此，在进行斑马鱼心研究时常选用H9c2细胞作为模型。然而，H9C2细胞增殖相关基因与班马鱼心再生基因仍存在差异，除miR-133基因家族外，其他并不相同，对于单个miRNA的功能仍需开展深入研究[16]。

由于H9C2细胞在不同条件下具有向骨骼肌和心肌细胞分化的能力，不同分化状态的细胞对毒物的敏感性不同[17]。Lenco等利用蛋白组学分别检测H9C2细胞、原代分离的乳鼠心肌细胞和成年大鼠心室肌细胞时显示，在H9C2细胞中最典型的12种横纹肌特征蛋白中没有一个具有心肌横纹肌表型，未分化的H9C2细胞与新生心肌细胞和成年心肌的表型存在显著差异[18]。Branco等利用低血清浓度培养基和全反式维甲酸诱导H9C2细胞分化为心肌细胞样细胞（H9C2 cardiac-like phenotype cell，H9C2 CM），并研究了H9C2 CM细胞的基因表达谱，发现参与钙调控、糖酵解和线粒体代谢相关的基因表达增加，与心肌收缩、扩张型心肌病等相关的基因表达明显上调，从而证实了心肌细胞样表型的存在[19]。利用同样的诱导方法，Kankeu等[20]采用蛋白质组学技术分析发现，H9C2细胞分化的早期改变与心肌形态形成和鞘脂合成的蛋白途径有关。另外，心细胞的分化状态影响其对毒物的易感性，线粒体凋亡通路在未成熟心肌细胞中比在成年心肌细胞中更活跃[21]。分化程度越高的H9C2细胞对阿霉素线粒体氧化应激和凋亡信号的敏感性越低[22]。由此可见，在利用H9C2细胞作为心细胞模型时，先将其诱导细胞分化为H9C2 CM细胞更具研究意义[17]。

目前，很多研究通过对H9C2细胞诱导和改造，使其更接近心肌细胞的表型。传统的方法是利用全反式维甲酸诱导或改变细胞外基质微环境[23]。Singla等研究表明，向H9C2细胞内转导Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子可使其成为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS），该细胞在培养系统中具有向心肌细胞分化的潜能，并能在体内修复梗死后的心肌，改善心功能[24]。另有报道H9C2细胞诱导的iPS细胞在小鼠糖尿病心肌梗死模型心肌中可分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞[25]，表明其具有多向分化的潜能。

2 小鼠HL-1心房肌细胞系

2.1 HL-1细胞的来源和基本特性

小鼠HL-1心房肌细胞系是1998年Claycomb教授从Jackson实验室成年雌性近交系C57BL/6J小鼠身上切除的AT-1皮下肿瘤中获得的，该细胞可以连续传代，表现心细胞形态、生化及电生理特性，具有自发的收缩能力和小鼠胚胎心房肌细胞的超微结构特征；HL-1细胞的α-心肌球蛋白重链、α-心肌动蛋白、连接蛋白CX43和心房利钠因子等与成年心房肌细胞具有相似的基因表达模式[26]。Pelloux等[27]报道HL-1细胞具有二氢吡啶受体L型钙通道，但没有发现规则肌节的存在。另外，HL-1细胞具有心房心肌细胞典型的乙酰胆碱激活的K+内向整流电流[28]，并具有HCN家族基因参与编码的超极化激活电流，这是心脏起搏产生和参与调节的基础[29]。

为了维持HL-1细胞收缩功能和心细胞表型，需要纤维连接蛋白-明胶基质和特殊配方的生长培养基等培养条件[30]。随着心肌组织工程生物材料的发展，生物支架的应用改变了心肌细胞排列形式，增强了跳动能力和生物活性[31]。细胞的汇集度是HL-1细胞分化的重要因素，高密度培养条件下可增强其收缩活性[32]。

2.2 HL-1细胞的亚克隆

2006年，Pelloux研究组在HL-1细胞株的基础上分离出不具有跳动功能的细胞株（non-beating HL-1，NB HL-1）。该细胞株与原HL-1细胞相比，除不具有If起搏器电流和自动去极化外，几乎具备原细胞株的所有特征[27]。在能量代谢方面，NB HL-1细胞与成体大鼠心肌细胞相比，具有较低的氧化磷酸化能力，但糖酵解系统能力较强，糖酵解系统是能量消耗反应中ATP的主要来源[33]，缺乏搏动的NB HL-1细胞在形态学研究及线粒体呼吸代谢研究方面具有较好的优势[27]。

为获得更加稳定一致性的细胞系，Diasn等[34]从原HL-1细胞系低密度培养中分离出1、2、3、4、6亚克隆株，其中第6亚克隆细胞（HL1-6）在细胞密度低的情况下具有稳定的收缩表型，其细胞肌节更为典型，动作电位和成年心房肌细胞相似。Houston等[35]证实HL1-6作为心肌细胞房颤模型更为稳定。

2.3 HL-1细胞主要应用优势

HL-1细胞是体外研究心率失常较好的细胞模型[36]。采用连续均匀高频率的电场刺激能够成功制作细胞房颤模型[37]。转录组学研究体外HL-1细胞房颤模型显示，HL-1细胞与人类房颤转录组主要基因的改变基本一致[38]，形态上出现相似的肌溶解现象[39]。HL-1细胞具备能分裂传代和体外容易培养等优势，有利于基因的导入和敲低，是研究心律失常相关基因优先选择的细胞[40]。同时，HL-1细胞也是心房细胞体外研究首选的细胞系[41]，在探索心功能调节信号通路等方面发挥重要作用[42]。

3 成人心室心肌AC16细胞株

3.1 AC16细胞基本特征

2005年，Davidson等[43]建立了成人心室心肌AC16细胞株，为研究人类心发生机制和心肌疾病的问题提供了便利。该团队利用原代成人心室组织的细胞与转入SV40T抗原基因合并尿苷缺陷性人类成纤维细胞融合，经过亚克隆和细胞筛选获得AC16细胞克隆。AC16细胞具有心肌细胞的细胞核和线粒体，表达转录因子GATA4、MYCD 和NFATc4，具有β-myosin重链、心肌动蛋白、肌钙蛋白I、辅肌动蛋白、中间丝蛋白、肌间线蛋白、缝隙连接蛋白和桥粒斑等心肌特征性蛋白[43]。该细胞最重要的特征是能控制细胞的增殖和分化状态，当使用RNAi技术沉默致癌基因SV40时，细胞从增殖状态转变为分化状态，表达心特异性标记物BMP2，而增殖细胞不表达BMP2。AC16为研究心肌发育的转录调控提供了良好模型，但由于该细胞不具有瞬时K+电流、L型Ca2+电流和If等典型电流，不能产生动作电位，不具有细胞收缩功能[43]。因此，AC16不适合心肌细胞的电生理研究。

3.1 AC16细胞的研究适用优势

由于AC16保留了原代人心肌细胞的细胞核和线粒体DNA，具有完整的功能呼吸链，是探索心肌线粒体功能调节、氧化应激、能量代谢和药物或环境对线粒体毒性等研究的优先选择[44]，在研究甲基汞对AC16和H9C2心肌细胞线粒体影响时显示，AC16细胞在线粒体ATP生成能力方面有更好的药物毒性剂量依赖性[45]，而线粒体介导的细胞凋亡途径影响细胞的活性和最终命运。因此，AC16细胞在研究心肌细胞活性和凋亡方面具有重要应用价值[46]。另外，AC16细胞具有成人心室肌细胞所有的DNA序列，决定了它在基因水平上研究的优势[47-48]，采用二代测序和生物信息学方法分析低氧组和正常组AC16细胞显示，AC16细胞的mRNAs和miRNAs的改变与心功能密切相关[49]。

4 新型心肌细胞株

成熟的心肌细胞株是研究心血管疾病的重要材料，许多研究人员曾尝试将SV40大T抗原永生基因转入心肌细胞建立细胞系。2013年，朱高慧团队利用腺病毒载体把两侧带有loxP位点的SV40大T抗原基因转入15.5 d胎鼠心室肌组织细胞，使细胞得到永生化，构建了iCP15心肌细胞株，iCP15细胞表现出较强的增殖活性，并且其增殖可以通过Cre重组酶去除SV40大T抗原而发生逆转，从而向心肌细胞分化[50]。2018年，Liu等[5]采用慢病毒载体把由强力霉素条件控制表达的SV40大T抗原基因转入新鲜分离的新生大鼠心房肌细胞（immortalized atrial myocyte，iAM），获得无限增殖能力的心房肌iAM-1细胞。该细胞在强力霉素条件下培养进入增殖状态，丧失了大多数心肌细胞特征，其增殖速度较快，比目前广泛使用的HL-1细胞高10倍，在缺乏强力霉素的条件下，细胞停止分裂增殖，向心房肌细胞表型分化，在肌节、收缩能力、电特性等方面和原代分离心肌细胞相似[5]。新型细胞株最明显的特点是能够利用基因调控技术控制细胞的增殖和分化，从而更有利于控制细胞状态的一致性。

5 问题与展望

人类的心脏疾病复杂多样，致病机制的调节难以复制，而心肌细胞株有其良好的遗传稳定性和单一的生存条件，更有利于重复模拟单因素试验研究。因此，需要构建更好的心肌细胞株来满足当前科研需要。但目前通过体外构建的心肌细胞株与来自体内的心肌细胞表型及功能仍存在差异，科学家应该寻找新的诱导药物，同时充分利用现代生物技术（如基因编辑技术），通过改良细胞培养环境，研发新的细胞培养载体，构建与人类心肌细胞形态和功能更为接近的心肌细胞株，为心血管疾病研究及临床应用提供更大便利。