基于多成分测定的小儿咳喘灵口服液的质量评价

钱叶飞，陆林玲，张华锋，蔡雪萍（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

小儿咳喘灵口服液由麻黄、金银花、板蓝根、甘草、苦杏仁、石膏和瓜蒌7 味中药组成，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的功效，临床上广泛用于治疗上呼吸道感染、咳嗽、支气管炎、肺炎等病症，是儿科常用的中成药之一[1-3]。经国家药品监督管理局网站查询，目前小儿咳喘灵口服液生产厂家有85 家，涉及85 个批准文号，质量标准主要收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第四册（WS3-B-0689-91）[4]，但该标准只有方中石膏与麻黄的理化鉴别，无薄层色谱鉴别及含量测定项，质量标准简单，专属性不强，无法全面控制该类制剂的质量，而对制剂中多指标含量控制是中药质量标准的大势所趋，也是中药现代化的必然要求。

目前文献多采用HPLC 法分析小儿咳喘灵口服液中相关中药的主要成分[5-12]，为节约时间成本，加快检验进度，本文建立了UPLC 双波长法同时测定板蓝根的活性成分（R，S）-告依春，金银花的活性成分绿原酸，苦杏仁的活性成分苦杏仁苷及甘草的活性成分甘草苷和甘草酸共5 个成分的含量，可较全面反映小儿咳喘灵口服液的质量；同时对不同厂家样品的质量特征分析，为小儿咳喘灵口服液质量控制提供更多的数据支持。

1 仪器与试药

Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色谱仪[二极管阵列检测器（PDA）、Empower 3 化学工作站（美国Waters 公司）]；电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Millipore Synergy 超纯水机（美国密理博公司）。

（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、苦杏仁苷对照品（批号分别为111753-201706、110753-201716、111610-201607、110820-201607；纯度分别为100%、99.3%、93.1%、90.7%）（中国食品药品检定研究院）；甘草酸对照品（批号为MUST-17060805，纯度为99.65%，成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

59 批小儿咳喘灵口服液样品均为市售，来自于6 个厂家，具体信息见表1。

表1 59 批小儿咳喘灵口服液样品Tab 1 Samples of 59 batches of Xiaoer Kechuanling oral liquid

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，线性洗脱梯度（0～4.5 min，5%～6%A；4.5～12.0 min，6%～20%A；12.0～17.0 min，20%～30%A；17.0～21.0 min，30%～45%A；21.0～22.0 min，45%～90%A；22.0～24.0 min，90%A；24.0～24.1 min，90%～5%A；24.1～26.0 min，5%A）；体积流量0.3 mL·min－1；柱温：35℃；检测波长：207 nm（苦杏仁苷）、237 nm [（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷和甘草酸]；进样量：1 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

取（R，S）-告依春、甘草酸、甘草苷、苦杏仁苷和绿原酸对照品10.83、9.27、10.88、11.80、10.07 mg 置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容至刻度，分别制得含（R，S）-告依春1.0830 mg·mL－1、甘草酸0.9238 mg·mL－1、甘草苷1.0129 mg·mL－1、苦杏仁苷1.0703 mg·mL－1和绿原酸1.0000 mg·mL－1的对照品溶液储备液。分别精密吸取对照品储备液各2 mL 置于20 mL 量瓶中，定容至刻度，制得含（R，S）-告依春108.3000 μg·mL－1、绿原酸99.9951 μg·mL－1、甘草酸92.3756 μg·mL－1、甘草苷101.2928 μg·mL－1和苦杏仁苷107.0260 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品10 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按小儿咳喘灵口服液质量标准规定中处方的药材比例及生产制备工艺，分别制备缺板蓝根、苦杏仁、甘草、金银花的阴性样品口服液。按“2.3”项下方法操作，分别制成缺板蓝根、缺苦杏仁、缺甘草、缺金银花的阴性样品溶液。

2.5 含量测定

2.5.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各1 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。结果缺板蓝根、缺金银花、缺苦杏仁、缺甘草阴性样品在对照品相应保留时间处无明显色谱峰，表明阴性样品对测定无干扰，该方法专属性良好（见图1）。

图1 小儿咳喘灵口服液UPLC 色谱图Fig l UPLC chromatogram of Xiaoer Kechuanling oral liquid

2.5.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，按“2.1”项下的色谱条件，分别进样，记录各组分的峰面积。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程以及相关系数。结果表明5 种有效成分的线性关系均良好（见表2）。

表2 线性关系考察Tab 2 Linearity

2.5.3 精密度试验 精密吸取同一批供试品溶液（批号：171206），连续进样6 次，结果（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷5个成分峰面积的RSD分别为1.4%、0.11%、1.2%、0.38%、0.21%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液（批号：171206），分别于0、6、12、18、24 h 进样测定。结果（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷的峰面积RSD分别为1.2%、1.2%、0.39%、0.90%、1.5%，均小于3.0%，表明供试品溶液24 h 内较为稳定。

2.5.5 重复性试验 精密称取同一批口服液样品（批号：171206）6 份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，进样测定，结果（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷5 个成分的峰面积的RSD分别为2.0%、0.22%、0.20%、0.41%、0.38%，均小于3.0%，表明该方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收试验 取已知含量的同一批口服液样品（批号：171001），精密量取9 份，（R，S）-告依春每份0.5 mL，绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷每份5 mL，分别精密加入低、中、高浓度水平的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果（R，S）-告依春低、中、高浓度的平均加样回收率分别为103.3%、97.2%、96.2%，RSD分别为0.97%、0.74%、0.66%；绿原酸低、中、高浓度的平均加样回收率分别为103.4%、97.1%、99.2%，RSD分别为0.69%、0.51%、1.1%；甘草苷低、中、高浓度的平均加样回收率分别为101.1%、98.5%、99.6%，RSD分别为2.1%、1.3%、0.82%；甘草酸低、中、高浓度的平均加样回收率分别为99.5%、97.2%、99.1%，RSD分别为2.2%、1.7%、0.49%；苦杏仁苷低、中、高浓度的平均加样回收率分别为97.5%、96.3%、97.8%，RSD分别为0.71%、0.53%、1.9%。

2.5.7 耐用性试验 本试验考察了Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters Acquity HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）两种色谱柱，各组分均能够达到比较理想的分离效果，表明该方法耐用性良好。

2.6 样品含量测定

对6 个生产厂家的59 批小儿咳喘灵口服液样品按“2.2”项下方法制备样品，按“2.1”项下色谱条件进行测定，每个样品平行2 份，计算5个成分的含量，结果见表3。

表3 59 批小儿咳喘灵口服液中5 个成分的含量(n ＝2，mg·L－1)Tab 3 Content of 5 constituents in 59 batches of Xiaoer Kechuanling oral liquid (n ＝2，mg·L－1)

2.7 不同厂家之间离散程度直观分析

分别对6 个厂家多批次样品各成分的含量范围进行统计，结果见表4。结果显示所测5 个成分在所有批次样品中均可检出，但不同厂家之间的含量差异较大，厂家3 各成分的含量均较其他厂家较低。

表4 不同厂家小儿咳喘灵口服液5 种成分含量范围(mg·L－1)Tab 4 Content range of 5 components of Xiaoer Kechuanling oral liquid from different manufacturers (mg·L－1)

对大于等于5 批次的生产厂家的所有批次样本进行统计，计算其平均含量及RSD，以对各厂家样本的批间一致性进行评估，结果见表5。由表5可知，小儿咳喘灵口服液不同厂家样品中绿原酸、甘草苷和苦杏仁苷含量高低顺序均为厂家5 ＞厂家2 ＞厂家1 ＞厂家4 ＞厂家3，（R，S）-告依春含量高低顺序为厂家1＞厂家4＞厂家2＞厂家5 ＞厂家3，甘草酸含量高低顺序为厂家2 ＞厂家1 ＞厂家5 ＞厂家4 ＞厂家3；5 种指标成分的均值均为厂家3 最低；此外各厂家5 种指标成分的批间差异亦较为明显。

表5 不同厂家小儿咳喘灵口服液成分均值及RSD (mg·L－1)Tab 5 Mean ingredients and RSD of Xiaoer Kechuanling oral liquid from different manufacturers (mg·L－1)

2.8 单因素方差分析

为进一步客观分析不同生产厂家样品间差异，本实验运用SPSS 18.0 软件，采用单因素方差分析对所有样本的主要成分含量[（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷]差异进行统计分析。经分析，样品数据不具有方差齐性特点，因此选择了Tamhane’s T2（基于t检验的多重比较）检验，结果见表6。由表6可知，小儿咳喘灵口服液中（R，S）-告依春，厂家1与厂家3，5，6 之间均存在显著差异，厂家3 与厂家4，5 之间具有显著差异，厂家4 与厂家5，6 之间具有显著差异，厂家5，6 之间具有显著差异；绿原酸，厂家3 与厂家1，2，4，5 均存在显著差异，厂家4 与厂家1，2，3，5 间存在显著差异，厂家6 与其余各厂家质量接近；甘草苷，厂家5 与其余各厂家均存在显著差异，厂家3 与厂家1，2，4 均存在显著差异，厂家4 与厂家1，2 间存在显著差异；甘草酸，厂家3 与厂家1，2，4，5 均存在显著差异，厂家4 与厂家1，2，5 间存在显著差异；厂家6 与厂家2 间质量差异较大；苦杏仁苷，厂家2 与厂家1，5 之间无显著差异，厂家4 与厂家6 之间无显著差异，其余厂家间均具有显著差异。整体认为，厂家3 和厂家4 分别与其他厂家之间都具有显著差异。从成分来说，不同厂家之间的显著性主要体现在苦杏仁苷和甘草苷上。

表6 小儿咳喘灵口服液Tamhane’s T2 检验Tab 6 Tamhane’s T2 test of Xiaoer Kechuanling oral liquid

3 讨论

3.1 含量测定有效成分的选择

麻黄为小儿咳喘灵口服液的君药，但因其主要成分麻黄碱和伪麻黄碱具有挥发性，提取方法与其他成分不同，且普通的C18色谱柱对麻黄碱与伪麻黄碱的分离效果不佳[13-14]，故对制剂中麻黄的质量评价需另行开展；而石膏、瓜蒌的主要成分尚不明确，故本试验选择板蓝根、苦杏仁、甘草和金银花4 味药材的指标性成分作为该制剂的检测分析对象。

3.2 检测波长的选择

本试验采用二极管阵列检测器在200～400nm 波长进行扫描考察，并结合2015年版《中国药典》，以吸光度大小和分离度作为指标，最终选定237 nm 和207 nm 双波长进行检测。

3.3 小结

本试验主要对6 个厂家共59 批次的小儿咳喘灵口服液中5 个指标成分的含量进行了测定并统计分析。从含量测定结果及RSD的结果可以看出，不同厂家和同一厂家不同批次生产的小儿咳喘灵口服液5 种成分含量差异均较大，质量参差不齐，可能受药材的产地、采收季节、生产工艺等因素的影响，亦可能与目前质量标准中缺乏对其相关指标进行控制有关[15]，因此加强对指标成分的控制对于规范投料，提升药品品质尤为重要。此外，通过对各厂家的批间差异进行统计分析，反映出各厂家批间差异较大，这也是未来药品生产过程中应该关注的问题。开展严格的投料控制和生产过程控制将有利于改善这一问题，这也是从根本上实现市售产品质量控制，提高药品安全性、有效性的可行路径。