基于转录组学技术研究老年原发性高血压肾气亏虚证的理论探讨*

2021-03-26孙仪萱

中医研究 2021年10期

孙仪萱，张磊，戴霞

(1.山东中医药大学 2018级硕士研究生，山东济南 250000； 2.山东中医药大学附属医院心内科，山东济南 250000; 3.山东中医药大学中医养生学教研室，山东济南 250355)

心脑血管健康是人体健康的重要组成部分，一旦出现相关疾病，就会使患者的生命健康受到极大威胁。原发性高血压是诱发心脑血管疾病的危险因素之一，是较常见的慢性疾病，其中老年原发性高血压是原发性高血压的基本临床亚型之一。我国公民原发性高血压患病率为25.2%，全国每年因其致死的人数有二百余万，其中老年患者占66.6%[1-4]。动脉硬化、器官功能受损等导致老年原发性高血压患者血压波动大，易产生复杂的并发症，从而给机体造成不可逆的损伤，病死率高，严重威胁着老年人的生命健康。同时，老年原发性高血压迁延难愈、难以控制，加重了患者的医疗负担；其普遍性亦加重了社会医疗保障体系的经济压力，给社会的发展和进步带来不利影响。因此，对老年原发性高血压的发病机制和治疗进行研究刻不容缓。目前，已有多种技术应用于原发性高血压的研究。邵泽[5]采用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用技术(UHPLC-Q-TOF/MS)探讨原发性高血压阴虚阳亢证的代谢组学特征，最终找到38个差异代谢物，为明确原发性高血压阴虚阳亢证的生物标志物提供了可能性。夏立立[6]应用极速脉搏波技术分析中药潜阳育阴颗粒对老年原发性高血压昼夜节律异常患者相关中医证候的改善及对血管弹性的影响，对老年原发性高血压的治疗及预后提供了思路。吴静等[7]应用组织多普勒成像技术于心尖四腔观获取右心室侧壁右房室瓣环处心肌运动频谱图，用以评价老年原发性高血压患者右心室功能，为原发性高血压并发症的研究开拓了新思路。但是，转录组学应用于老年原发性高血压的相关研究相对匮乏，故对其做下述分析。

1 转录组学技术概述

随着后基因组时代的来临与发展，相关研究成果日益涌现。有学者于2001年提出系统生物学，即探究生物体的基因、蛋白质及代谢物在一些特定因素(如遗传、化学、外部环境等)干预之下会有何种变化，构建相关数学模型，从而实现对生命体生命活动及生物功能的认知和预测。它包含了转录组学、基因组学、蛋白组学及代谢组学等学科，其中，转录组学率先发展起来且应用最为广泛[8]。转录组学是在整体水平上研究生物体特定生理条件下或某一阶段中某一细胞或组织所有基因转录情况及基因调控规律的学科[9]。它的研究对象为转录组，转录组的概念由Victor等[10]在1997年研究酵母基因的表达时提出。转录组可分为广义与狭义两个层面。广义的转录组指在一个活细胞中经由基因转录出的所有核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的总和，在这些RNA中包含信使核糖核酸(messenger RNA， mRNA)和非编码核糖核酸(non-coding RNA，ncRNA)两种。狭义的转录组是指mRNA，其作用是编码蛋白质。遗传学著名的中心法则揭示了生物体内的mRNA将脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)上的遗传信息传递到蛋白质，此过程即为转录，完成了由DNA到蛋白质之间的信息传递，实现了基因对生物体生理机能的调控。

近十几年来，随着分子生物学技术及高通量技术的快速发展，尤其是下一代测序(next-generation sequencing，NGS)平台的市场化，转录组学测序技术以其成熟的整体性、系统性、个体组织差异性、时间独立性等优势彻底改进了转录组学的思维方式，更好地推动了转录组学的研究。目前，转录组学测序技术包括RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)、基因表达系列分析技术(serial analysis of gene expression,SAGE)、序列标签技术(expressed sequence tags,EST)，以及大规模平行测序技术(massively parallel signature sequencing,MPSS)[11]。在这些技术之中，EST是作为先驱而较早发展。随着相关研究的不断发展、相关技术的不断进步，在高通量测序条件下出现了RNA-seq、SAGE和MPSS等新兴转录组学的研究方法。其中，基于NGS技术发展起来的RNA-seq测序技术，相比于其他方法，测序通量更高，测序速度更快，同时兼具信噪比高和价格低等优势，成为目前转录组学分析的主要手段。

转录组学作为近年来新兴起的临床科研热点，主要研究目的包括：对所有转录组进行分类，确定基因的转录结构、剪接形式及其他转录后修饰等；对细胞或组织在不同情况下的基因表达水平进行量化分析，从而有助于进一步的临床研究。通过转录组学分析，可以揭示内在的基因表达与外在的生命现象之间的联系，以便更加深刻地理解机体发育和生理病理机制。在目前的临床科研中，转录组学在针对疾病的基因突变规律、发生的机制及致病基因控制的关键靶点等领域已经发挥了重要的作用，对于疾病预防、诊断、个性化治疗及预后等方面具有重要的指导意义。

2 转录组学在中医证候研究中的应用

证候是中医学理论中随着疾病的发生发展而变化的、揭示人体在疾病中的病理本质的概念，包含了病位、病因、病性及正邪强弱关系等信息，是中医学整体观念的集中体现，也是中医认识疾病和辨证论治的基础。在整个中医学术界的研究问题之中，证候研究是一个重点、难点问题，需要对其加以更大的关注度和研究力度。中医的证候是由望、闻、问、切四诊合参所获得的症状与体征的信息汇总而来，具有模糊性与主观性，无法用微观的量化标准去衡量，局限了中医与现代科学的结合，阻碍了中医药理论国际化发展。因此，只有采用与证候复杂性相适应的系统生物学理论及思维方法对其进行研究，将外在证候与疾病本质有机地整合起来，才有可能揭示其科学内涵。而转录组学的时间性与整体性与中医证候理论中随疾病转归而变化的辨证方法不谋而合，同时其微观性特点弥补了中医学理论在微观领域的不足。此外，目前中医证候学基础研究[12]在分子领域是以探寻证候物质——生物标志物群基础为目的，通过对基因组、蛋白组，以及作为两者之间枢纽的转录组进行研究来发现其中的表达异常和特异代谢组分。研究转录组可以解读基因组功能元件以揭示细胞或组织的分子成分，也可以理解细胞、组织生长和疾病发展的过程[13]，有利于解释证候的发生发展机制。

随着转录组学技术的发展及中医证候学理论研究的深入，近年来已有不少学者将转录组学成功运用于中医证候分析与药物治疗中，并取得了良好进展。罗琦等[14]对肠易激综合征脾虚腹泻患者进行研究，发现患者结肠黏膜中的5-羟色胺受体使核糖核酸出现异常表达，此有可能是致病原因。廖江铨等[15]运用高通量测序技术和实时聚合酶链反应(real-time PCR)技术筛选血瘀型冠心病相关差异表达长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，发现血瘀型冠心病组39个lncRNA差异表达(Fold change>2，p-value<0.05)，上调和下调的lncRNA分别为3个和36个。杨婵娟等[16]采用Aglient表达谱芯片筛选了正常人表达基因与慢性乙型肝炎患者表达基因的不同点，在选择出其中的表达基因之后，通过数据库的数据资料对这部分表达基因进行分析，并构建其动态网络。经过上述研究，最终找到最具有显著差异的9个表达基因(LOC340508、HIST2H2BE、MPL、FLJ22536、TUBA8、NT5M、EGFL7、PTPRF、TSPAN33)，而这几种表达基因广泛应用于细胞生长、信号转导、免疫反应、炎症反应及DNA损伤等领域。王东生等[17]使用大黄虫丸对动脉栓塞患者进行了治疗，并将药物干预前后血小板中的基因进行了对比，最终筛选出了243个差异基因。

3 基于转录组学技术研究老年原发性高血压肾气亏虚证的理论探索

中医学认为，老年人因本虚标实而罹患老年原发性高血压。本虚即正气虚，先天之精不足，而肾纳先天之精，主骨生髓。髓海为脑，髓海失去肾精濡养，脑与肾上下俱虚，遂发为眩晕。此为老年原发性高血压肾气亏虚证的基本病机，在临床实践中得到了印证。如：刘志军等[18]将515例原发性高血压患者进行辨证分型，发现肾气亏虚证患者最多(69例，占13.4%)，提示肾气亏虚证是老年原发性高血压的主要证型；于杰等[19]采用益肾降压方药治疗老年女性原发性高血压肾气亏虚证，结果提示益肾降压方可调节老年女性原发性高血压肾气亏虚的特征性激素指标E2的释放，有效减少及延缓合并症，保护靶器官，从而改善患者的身体状况、提高生活质量。故笔者对基于转录组学技术研究老年原发性高血压肾气亏虚证的可行性进行了探讨。

首先，理论可行。老年原发性高血压肾气亏虚证具有整体性与动态性，靶点多，病机复杂，无法通过单一的微观定量分析进行研究。现代生物数学观点认为：有大量的非线性现象出现在生命科学的研究之中。对于这些非线性现象规律的解释，可以通过引入类似人脑辨析思维的“神经网络”及非线性动力学为主的理论和方法，并建立相关数学模型来实现。转录组学反映的是在整体水平上生物体某一阶段或特定生理条件下某一细胞或组织所有基因转录情况及基因调控规律，对其进行研究可以从整体的角度捕捉细胞及生物体的生理、病理活动的动态性。而原发性高血压肾气亏虚证的外在症状与内在机制会随着疾病进程的推进而不断发展变化。两者的理论特性不谋而合。同时，转录组学的微观性特点弥补了中医学理论中老年原发性高血压肾气亏虚证在微观领域认知的不足。除此之外，转录组作为基因组与蛋白组联系的中间枢纽，对其进行研究可以反映基因组功能元件的作用，揭示细胞、组织的生长过程及疾病产生、发展更根源的问题，进一步探索老年原发性高血压肾气亏虚证的更微观的病理机制，对疾病发展中的潜在危险进行预测，与中医“上工治未病”的思想观念更吻合，可为中医治未病思想及临床科学用药提供理论依据。

第二，技术可行。首先，随着高通量的RNA-seq技术的出现与发展，转录组学技术逐渐成熟与完善，被广泛应用于生物学及医学领域。其在医学界的逐步普及证明了其应用于医学研究的可行性。目前，研究者们已开辟出了成熟的技术路线，有大量系统的研究思路可以借鉴。其次，在中医学研究中，中医证候学研究一直是热点，也是一直以来阻碍中医学与现代科学接轨、走向世界的一大难点问题，急需寻找一个可同时与中医证候学、现代科学思路相吻合的研究方法，转录组学应用于中医证候学研究即是其中的一个新思路。

第三，目前，转录组学技术应用于老年原发性高血压肾气亏虚证的相关研究欠缺。通过检索大量文献可知，目前转录组学应用于中医临床多个领域。田蕾等[20]基于转录组学测序技术分析肝失疏泄人群的差异表达基因，发现肝失疏泄人群与肝主疏泄组相比有55个显著差异基因，其中上调基因35个，下调基因有20个。赵利南等[21]运用RNA-seq技术筛选活血化瘀治法干预下大鼠乳腺癌的关键基因，得出：PBCRS可能通过干预乳腺癌组织中的FBPI的表达从而抑制乳腺癌发生的结论。王阶等[22]运用差异显示法、实时聚合酶链反应、半点杂交法、高通量芯片、测序等方法对312例冠心病血瘀证患者外周血进行研究，确立了冠心病长链非编码核糖核酸-微小核糖核酸-信使核糖核酸3个层面的潜在生物标志物。但是，针对老年原发性高血压肾气亏虚证患者的转录组学分析研究欠缺，成果鲜有报道，老年原发性高血压肾气亏虚证在转录组学层面的生物学本质尚未探明，亟需开展相关研究。