CPT1A基因在广西麻鸡的表达研究

屠云洁，束婧婷，单艳菊，姬改革，章 明，刘一帆，巨晓军，唐燕飞，蒋华莲，邹剑敏*

(1. 江苏省家禽科学研究所，江苏省家禽遗传育种重点实验室，江苏扬州，225125；2. 广西富凤农牧集团有限公司，广西 南宁，530024)

棕榈脂酰肉碱转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)是脂肪酸β-氧化的限速酶，对脂肪的分解供能具有重要的调控作用。CPT1与机体脂肪的沉积有密切的关系，其表达水平与体脂含量相关，表达水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低体脂肪含量[1-2]。肝亚型(CPT1A或CPTI-L)是CPT1的一种重要亚型， CPT1A定位于11q13.2，是肝脏组织细胞中长链脂肪酸β-氧化的限速酶和关键调节酶[3-4]。CPT1A在淋巴瘤、食管癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，抑制CPT1A活性和表达的药物具有明显的抗肿瘤作用。CPT1A在能量代谢中具有重要作用，与心肌肥厚、糖尿病等许多代谢疾病的发生发展有密切的关系，对其深入研究将为脂代谢相关疾病的药物治疗提供新的思路[5-6]。肉鸡的体脂是肉鸡产业的主要关注点之一，肉鸡生长速度和腹部脂肪沉积很快，所以肉鸡可以作为研究质代谢、肿瘤和生长发育等的模型[7-8]。研究表明，牛，羊等哺乳动物CPT1AmRNA存在不同组织差异表达性，并存在品种和个体差异[9-10]，作者前期研究发现CPT1A在隐性白羽鸡产蛋高峰期(217日龄)在肝脏的表达量高于其他组织[11]，但未见CPT1AmRNA在肉鸡不同发育阶段的表达规律的报道。研究肉鸡CPT1A基因的时空表达调控规律对于了解肉鸡脂肪沉积规律和脂质代谢调控机理具有重要意义。本研究对广西麻鸡从胚胎期到性成熟的不同发育阶段CPT1A基因肝脏、心脏、胸大肌和腓肠肌mRNA表达量进行研究，以揭示CPT1A在广西麻鸡不同组织中以及同一组织不同发育阶段的相对表达量，为研究CTP1A基因在调控体内脂肪代谢过程中的作用提供一定的基础资料，为研究肿瘤和代谢性疾病提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物饲养管理

广西麻鸡种蛋来自广西某农牧集团有限公司，300个广西麻鸡种蛋在江苏省家禽科学研究孵化、出雏和饲养。饲养试验的程序按江苏省家禽科学研究所制定的饲养管理程序执行。 管理要求按照黄羽肉鸡饲养管理指南。小鸡群公母混合，育雏舍地面平养。42日龄转移到育成鸡舍，42～120日龄，公母分群饲养地面平养， 公母鸡之间要有要用拦网隔开，120日龄转移到个体笼饲养。

1.2 样品采集

每个发育阶段采集广西麻鸡10个样品，公母各5个，共采集11个时间点：9胚龄，12胚龄，16胚龄，1日龄，1、3、5、7、9、13和16周龄。屠宰后迅速采取腓肠肌、胸大肌、心脏和肝脏样本并投入液氮中，然后置于-80 ℃的冰箱中保存备用。

1.3 RNA的提取以及cDNA的合成

利用Trizol Reagent Kit试剂盒提取胸大肌、腓肠肌、心脏和肝脏RNA，cDNA第一链的合成按照反转录试剂盒的使用说明书进行，反转录产物保存于-20 ℃ 备用。 以提取的总RNA为模板，按照RT-PCR试剂盒 (Takara, Dalian, China) 说明书反转录合成cDNA第一链。反转录反应体系为 20 μL, 其中总 RNA 2 μL，OligodT20 1 μL, AMV 反转录酶 ( 200 U/μL) 1 μL , RNA 酶抑制剂 1 μL , dNTP Mix ( 10 mmol/L) 2 μL , 5×RT Buffer 4 μL, DEPC水9 μL。反转录条件42 ℃ 30 min , 99 ℃ 5 min。

1.4 引物设计

根据CTP1A和β-actin基因的mRNA序列，利用Primer 5.0 设计荧光定量PCR引物，由上海生物技术有限公司合成。

鸡CPT1A基因正反向引物序列为：F:5'-GCCCTGATGCCTTCATTCAA-3'，R:5'-ATTTTCCCATGTCTCGGTAGTGA-3'，鸡内参基因β-actin基因正反向引物序列为F:5'-GTCCACCGCAAATGCTTCT-3'，R:5'-TGCGCATTTATGGGTTTTGTT-3'。CPT1A和β-actin基因PCR扩增片段大小分别为60和58 bp。

1.5 PCR反应条件

Real time PCR扩增的反应条件设置如下：

CPT1A：95 ℃ 预变性 20～30 s, 然后 40 个循环的95 ℃ 变性20～30s, 退火55～60 ℃ 20～30 s, 最后95 ℃ 变性10～15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 10～15 s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

β-actin：95 ℃ 预变性 20 s, 然后 40 个循环的95 ℃ 变性20～30 s, 退火56～59 ℃ 20～30 s, 最后95 ℃ 变性10～15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 10～15 s ，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

1.6 mRNA定量数据分析

鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1A和β-actin基因各自优化好的条件进行Real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对CPT1A基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔ Ct法对数据进行处理，其中Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)，同一组织不同发育阶段的相对表达量，是以一个发育阶段基因表达量为参照，比如以3周龄Ct作为其他发育阶段的参照，计算相对表达量Ct，Ct=(CtXgroup-Ct参照)，以此来比较各组以相对于3周龄组表达倍数的变化显示CPT1A基因在不同发育阶段的相对表达量。利用前面同一组织不同发育阶段计算好的相对表达量，直接用SPSS 16.0的单因素方差分析中的Tukey检验，分析不同组织之间的相对表达量。

1.7 数据处理

试验数据用Excel 2007和SPSS 16.0 单因素方差分析法中的Tukey检验进行两两比较统计分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 溶解曲线分析

为检测反应的特异性，在Real-time反应后，进行溶解曲线分析，以确定得到的产物为目的产物。结果显示如图1，CPT1A和β-actin基因均只有一个特异性峰。则设计的CPT1A引物有很好的特异性，可以进行CPT1A基因定量析。

2.2 CPT1A基因在广西麻鸡不同组织和不同发育阶段的时空表达特性

CPT1A在广西麻鸡心脏、肝脏、胸大肌和腓肠肌时空表达规律见表1和图2。从表1可以看出，CPT1A在不同发育阶段4种组织中表达差异性不同。在胚胎期(9、12、16胚龄)，CPT1A基因在腓肠肌的表达量显著高于在心脏，肝脏和胸大肌的表达量(P<0.05)；1日龄和1周龄时，CPT1A在心脏的表达量显著高于其他3种组织；3周龄时，在4种组织中的表达量差异不显著(P>0.05)；5、7、9、13和16周龄时，CPT1A在胸大肌的表达量显著高于其他3种组织(P<0.05)。

由图2A可见，CPT1A在肝脏不同发育阶段变化呈现升高降低再升高的趋势。CPT1A在肝脏3、7和16周龄时的表达量显著高于胚胎期(9、12、16胚龄)，在胚胎期和1日龄的几个发育阶段的表达量差异不显著； 在1、5、7、9、13和16周龄这几个试验发育阶段表达量差异不显著。出雏后的各个试验阶段的表达量显著高于胚胎期(P<0.05)。

图1 β-actin 和CPT1A基因溶解曲线Fig. 1 CPT1A and β-actin gene dissolution curve

图2 CPT1A在广西麻鸡不同发育阶段4种组织中的相对表达量柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Fig.2 Relative expression of CPT1A in four tissues of Guangxi Partridge Chicken at different developmental stageDifferent lowercase letter above columns mean significant difference(P<0.05)

表1 CPT1A在广西麻鸡同一发育阶段4种组织相对表达量Table 1 Relative expression of CPT1A in 4 tissues at the same developmental stage

由图2B可见，CPT1A在心脏胚胎期的表达量逐渐升高，但差异不显著，1日龄和1周龄时的相对表达量显著高于胚胎期(P<0.05)，3周龄时的表达量显著低于1日龄和1周龄(P<0.05)，5周龄和7周龄时的相对表达量比3周龄时的表达量显著上升(P<0.05)，9、13和16周龄的表达量虽有先下降再升高的趋势，但差异不显著；CPT1A在出雏后的各个发育阶段的表达量显著高于胚胎期(P<0.05)。

由图2C可见，CPT1A在腓肠肌不同发育阶段呈现下降的趋势。CPT1A在腓肠肌胚胎期和1日龄表达量显著高于出雏后的其他各个实验发育阶段的表达量(P<0.05)，出雏后的几个发育阶段(1、3、5、7、9、13和16周龄)间的表达量差异不显著。

由图2D可见，CPT1A在胸大肌胚胎期到性成熟呈现升高的趋势，在胚胎期，1日龄，1周龄和3周龄表达量逐渐上升，但差异不显著，5周龄时表达量显著上升，随后7、9、13和16周龄的表达量有升高降低再升高再降低的趋势，但这几个阶段的表达量差异不显著。各个发育阶段表达量差异如下：5、7、9、13和16周龄>1周龄、3周龄、1日龄、9胚龄、12胚龄、16胚龄。

3 讨 论

CPT1A属于肝脏型棕榈脂酰肉碱转移酶，诸多研究报道CPT1A在肝脏中表达量最高。于宝莉等研究发现CPT1A基因在180日龄的绵羊和山羊肝脏中表达最高，但也存在个体差异和品种差异[9]。作者前期研究发现CPT1A在隐性白羽鸡产蛋高峰期(217 d)CPT1A基因在肝脏的表达量高于其他组织，且其表达量无性别差异，也无性别和组织互作的影响[11]。本研究也发现CPT1A在广西麻鸡公鸡和母鸡的不同组织中表达量差异不显著，无性别效应。所以只分析CTP1A在广西麻鸡不同组织不同发育阶段相对表达量。CPT1A广西麻鸡肝脏胚胎期和出雏后到性成熟(16周龄)的各个实验发育阶段表达量均较低，且变化趋势最缓慢，与其他研究结果不一致[9,11-12]，这可能与鸡的日龄和品种不同有关，不同品种不同发育阶段所需的能量不同。肝脏是动物脂肪代谢的主要部位，肝细胞液中的脂肪酸以及肌肉和其他组织细胞摄取的脂肪酸借助CPT-Ⅰ被转运至线粒体内，经β-氧化后生成乙酰CoA，肝脏中生成的乙酰CoA 除经三羧酸循环产生ATP 供自身利用外，更多的是转化为酮体运输到脑等肝外组织氧化利用[12]。

本研究还开展了CPT1A基因在广西麻鸡不同组织不同发育阶段的表达规律研究，CPT1A基因在胸大肌和腓肠肌的不同发育阶段变化趋势不同。

CPT1A在心脏胚胎期的表达量逐渐升高，1日龄和1周龄时的表达量显著上升，3周龄时的表达量显著下降，5周龄和7周龄时显著上升，9、13和16周龄之间差异不显著；CPT1A在胚胎期心脏表达量较低，在出雏后各个时期表达量较高，这可能由于鸡出雏后雏鸡运动量加大，心脏活动量加大，CPT1A对体内脂肪酸的氧化能力增强，为心脏提供更多的能量。CPT1A在腓肠肌胚胎期和1日龄表达量显著高于出雏后的其他各个实验发育阶段；CPT1A在胸大肌的变化趋势最显著，各个发育阶段表达量差异如下：5、7、9、13和16周龄>1周龄、3周龄、1日龄、9胚龄、12胚龄、16胚龄。有研究证实在肥胖及糖尿病人的研究中也发现肌肉中CPT1基因的表达与肌纤维发育快慢和类型有密切的关系[13-14]。有研究发现鸡胚胎期胸肌的发育均显著慢于腿肌[15]，出雏后的鸡胸肌和腿肌肌纤维发育快慢也不同[16]。在广西麻鸡胸大肌，腓肠肌，心脏和肝脏具有不同的表达模式，且不同发育阶段表达量变化趋势不同，提示不同部位组织发育的潜在分子机制可能存在差异。

4 结 论

CPT1A在广西麻鸡不同发育阶段4种组织表达量不同，在胚胎期，CPT1A基因在腓肠肌的表达量显著高于在心脏、肝脏和胸大肌、1日龄和1周龄时，CPT1A在心脏的表达量显著高于其他3种组织； 5～16周龄时，在胸肌的表达量显著高于其他3种组织。CPT1A基因在4种组织不同发育阶段变化趋势不同，CPT1A在肝脏各个试验发育阶段表达量均较低，且变化趋势最缓慢。CPT1A在腓肠肌胚胎期和1日龄表达量显著高于出雏后的其他各个发育阶段；CPT1A在胸大肌的表达量呈现逐渐上升的趋势，且变化趋势最显著，5、7、9、13和16周龄的表达量显著高于其他试验阶段。