引起某蛋鸡场产蛋率下降的病原分离鉴定

张 飘，李 涛，杨 霞，胡安东，潘吉脉，刘妍罕，曾茂芹，文 明,4*

(1. 贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵阳 550025；4.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)属芽孢杆菌科，蜡样芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，外界环境恶劣时会产生芽孢，兼性厌氧生存。近年来，蜡样芽孢杆菌大部分菌株作为有益微生物广泛地被添加到饲料和食品中，取得了可喜的效果，添加在饲料中可提高仔猪的生产性能[1]，甚至其还可以发酵降解羽毛[2]。但不可忽视的是该菌也是一种条件致病菌，在一定条件下会给机体带来严重的威胁[3]。黄晶菁等[4]报道，该菌曾被多次报道引起食物中毒，在养殖过程中引起动物机体发病甚至死亡，且新生儿上呼吸道感染和脐带炎也与蜡样芽孢杆菌相关。2019年11月贵州省某蛋鸡养殖场高峰产蛋蛋鸡产蛋率突然下降10%～20%不等，蛋壳变薄，鸡只出现零星死亡，送本实验室进行诊断，查找病因。

1 材料与方法

1.1 材料

发病产蛋活鸡(8只)，由贵州省某养殖场送检；普通平板、鲜血平板、麦康凯平板、LB培养基、生化鉴定管、抗菌药物药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒和DL2000 DNA MarKer均购自天根生化科技(北京)有限公司；25只15日龄雏鸡由贵州大学动物疫病研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 按照动物疫病调查常规方法进行鸡场蛋鸡产蛋下降的流行病学调查。

1.2.2 剖解病变观察 通过剖解病变观察对送检活鸡进行无菌病理剖解及大体病变观察。

1.2.3 病毒PCR检测 病毒PCR鉴定采集送检的8只发病蛋鸡的肺脏、肝脏和脾脏样本，单只组织样本混合,用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，PCR检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV，登录号为KU900742)、禽流感病毒(AIV)[5]、新城疫(NDV，登录号为AY325796)、减蛋综合征病毒(EDSV)[6]、禽白血病病毒 (ALV)[7]、支原体(MS)[8]和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV，登录号为EF552578)。PCR引物参照相关文献或标准株设计，引物及退火温度见表1，引物由上海生工合成，PCR反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4 细菌分离鉴定 无菌采集送检病鸡的肝脏、卵巢和法氏囊积液样本, 接种环划线接种于普通平板、鲜血平板、麦康凯平板,厌/需氧条件下均放置于37 ℃恒温箱培养24 h后挑取形态一致的优势菌落，平板划线得到纯培养菌株，再转接到LB液体培养基中震荡培养24 h后4 ℃备用。将分离纯化的菌落进行纯培养、革兰氏染色、镜检、观察菌体特征、接种于细菌生化鉴定管中，37 ℃恒温培养24～48 h后观察结果并参照《伯杰细菌鉴定手册》[9]进行判定；将分离纯化菌液在超净工作台中均匀涂抹于LB平板，用20种药敏片进行药敏试验，37 ℃恒温箱培养24 h，记录抑菌圈直径并根据抑菌圈直径判定分离菌的药物敏感性；将纯化后的细菌利用DNA提取试剂盒提取总DNA,并用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增有目的条带送深圳华大基因股份有限公司进行测序后，利用MEGA7.0和DNA star软件构建遗传进化树和同源性分析。

表1 基因引物信息Table 1 Gene primer information

1.2.5 半数致死量及动物回归试验 将分离的优势菌通过麦氏比浊法将菌液浓度调整至1.0×109cfu/mL，并将配好的1.0×109cfu/mL菌液按照10倍系列稀释至1.0×105cfu/mL，4 ℃备用。25只15日龄雏鸡分为5组，每组5只，每组每只均腹腔注射相同浓度蜡样芽孢杆菌1 mL，共计5个梯度浓度，观察雏鸡活动状态及死亡情况，直到不再出现雏鸡死亡，对死亡雏鸡组织进行平板划线，做生化试验，确定死亡原因，并观察发病雏鸡与送检病鸡是否具有相同症状。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查

贵州省某养殖场于2019年11月份开始，其产蛋高峰期蛋鸡突然产蛋率下降20%～10%不等，鸡只出现零星死亡，该蛋鸡厂蛋鸡发病前饲养环境、饲料及饮水未做改变，产蛋下降蛋鸡外观无异常。发病前一直有在饲料中添加中草药混合饲喂，发病后使用中草药治疗效果不佳，改用抗生素治疗，在使用部分抗生素后蛋鸡产蛋率恢复、不出现死亡蛋鸡，但停用后产蛋率又下降、鸡只出现零星死亡。

2.2 剖解病变观察

对送检发病活鸡进行剖解病变观察, 发现其主要病理变化为肝脏肿大质地变脆并伴有出血点，脾脏肿大，法氏囊透明化且内充满乳白色液体，盲肠端充气，其他脏器和组织无明显病变(图1)。

2.3 病毒PCR检测结果

通过普通PCR对送检的病鸡检测，未能扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫(NDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒 (ALV)、支原体(MS)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)7种病毒特异性核酸片段，说明未感染这7种病毒(图2)。

图1 剖解病理变化A. 脾脏肿大；B. 肝脏肿大质地变脆并伴有出血点；C. 法氏囊透明化且内充满乳白色液体；D. 盲肠鼓气Fig.1 Pathological changes

2.4 细菌分离鉴定结果

2.4.1 细菌分离 仅在肝脏鲜血平板生长出1种菌落并将其命名为GZ201911，其他组织器官未见细菌生长。形态整体呈蜡滴状，有溶血环，为不透明的白色菌落(图3)。挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检后观察到单个或链状排列的革兰氏阳性杆菌(图4)。

图2 病毒基因PCR扩增结果A. IBV;B. AIV;C. NDV;D. EDSV;E. ALV(A);F. ALV(B);G. ALV(J);H. MS;I. ILTVM. DL2000 DNA Marker；1～8.样品；+. 阳性对照；-. 阴性对照Fig.2 PCR results of virus genesM. DL2000 DNA Marker;1～8. The samples;+. Positive control;-. Negative control

2.4.2 细菌生化试验结果 纯化菌液接种于生化鉴定管中，结果发现该分离菌不具有运动性, 能利用葡萄糖、不能利用苯丙氨酸、蛋白胨水(靛基质)、木糖和枸橼酸盐等；不产生硫化氢, MR.VP反应阳性; 赖氨酸和鸟氨酸阳性, 符合蜡样芽孢杆菌的生理生化特征(表2)。

2.4.3 药敏试验结果 对药敏试验结果进行记录并分析(表3)，结果显示：该菌对氟苯尼考、环丙沙星、四环素、氧氟沙星、多西环素和克林霉素6种药物敏感，对复方新诺明、头孢他啶、哌拉西林、多粘菌素B、头孢氨苄等药物中度敏感,对青霉素、新霉素、克林霉素等药物耐药。

2.5 16S rDNA基因测序同源性分析

采用16S rDNA通用引物对分离菌株GZ201911进行PCR扩增，阳性产物经测序后得到大小为1 485 bp的基因序列(图5)。利用MEGA 7.0和DNAstar软件对分离菌株16S rDNA测序结果，建立系统进化树并做同源性分析发现：其与四川YB18株(KJ720022)亲源关系最近，同源性为99.8%；与巴西FT9株(CP008712)亲源关系最远，同源性为98.8%；与摩洛哥CCMMB613株JN208091、山西HDK07株KX905299、四川XH18株KU986648、四川YB18株KJ720022、湖北TD8株GQ381283、美国2000031486株AY138272、美国ATCC 14579株NR074540、朝鲜FORC60株CP020383、湖南HN1203株JX294967、巴西FT9株CP008712的同源性介于二者之间(图6)。

图3 分离菌株及溶血环Fig.3 Hemolysis of the isolated strain

图4 革兰氏染色菌落形态(1 000×)Fig.4 Colony morphoiogy of gram staining(1 000×)

表2 分离菌生化反应结果Table 2 Biochemical test results of the isolated strain

表3 分离菌株药敏试验结果Table 3 Susceptibility test results of the isolate

2.6 半数致死量及动物回归

根据改良寇氏法[10]计算LD50(lg(LD50)=Xm-d(∑Pi-0.5))：其中:Xm为最大剂量对数；d为相邻两组剂量对数之差数；Pi为死亡率,i为组号，经计算为5.01×107cfu/mL(表4)。对死亡雏鸡内脏组织进行细菌分离培养, 生化结果与原分离菌相同, 说明雏鸡死亡是由蜡样芽孢杆菌引起，雏鸡剖解症状与送检蛋鸡剖解症状相同，但发现法氏囊透明充满积液的症状较送检蛋鸡症状轻。

3 讨 论

引起蛋鸡产蛋率下降或者死亡的病因随着近年来养殖密度的不断加大也越来越多，其中包括新城疫病毒[11]、鸡传染性支气管炎病毒[12]、禽白血病病毒、鸡产蛋下降综合征病毒[13]等，但大多数都伴随相应的症状或者组织病变。而本次贵州省某蛋鸡养殖场蛋鸡突然发病，其主要病理变化为肝脏肿大，质地变脆，并伴有出血点；脾脏肿大，法氏囊透明化且内充满乳白色液体；盲肠端充气，症状不典型；其他脏器和组织无明显病变。经设计特异性引物检测常见引起产蛋率下降的相关病毒后未见PCR扩增出相应条带，通过细菌分离鉴定后分离出一株优势菌GZ201911，经16S rDNA PCR扩增后测序比对后为蜡样芽孢杆菌，该菌同源性分析发现其与四川株(KJ720022)亲源关系最近同源性为99.8%，与巴西株(CP008712)亲源关系最远同源性为98.8%。随后计算该菌半数致死量发现其对15日龄雏鸡半数致死量为5.01×107cfu/mL，发病雏鸡主要临床症状与送检蛋鸡相同，但发现雏鸡法氏囊透明充满积液的现象较轻，但具体引起蛋鸡法氏囊透明化且有积液的原因及相关机制还不清楚。药敏试验结果显示该菌对对氟苯尼考、环丙沙星、四环素、等药物敏感，而对复方新诺明、头孢他啶、哌拉西林、多粘菌素B等药物严重耐药，这为该蛋鸡养殖厂提供了用药的依据。

图5 16S rDNA PCR扩增凝胶电泳图M. DL200DNA Marker;1～2.16S rDNA；-. 阴性对照Fig.5 Gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplificationM. DL200DNA Marker;1～2. 16S rDNA；-. Negative control

图6 分离株与参考株16S rDNA基因序列系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene ofthe isolate and reference strains sequences

表4 人工感染雏鸡LD50Table 4 Artificially infected chick LD50

蜡样芽孢杆菌广泛分布于土壤、水、空气和饲料环境中[14]，人感染该菌后往往出现各种炎症，如眼球炎肺炎、心内膜炎等[15]。而动物机体感染后则表现出不同症状，如黄颡鱼蜡样芽孢杆菌引起的肝脏有点状或块状出血,胆肿大呈紫黑色等症状[16]；对罗非鱼则主要引起肝淡黄色, 肾充血发黑, 脾鲜红等症状[17]；对刺参则在体表出现溃烂蓝白斑及大面积溃烂[18]；对猪则主要集中在肺脏和心脏等器官出现白色点状坏死灶等症状[19]。在这里可以看出，该菌对不同动物机体致病后引起的相关症状存在较大差异性，但到目前为止均未见到有关于鸡感染源蜡样芽孢杆菌的相关报道，及由该菌引起鸡发病后的主要临床症状。鸡在感染蜡样芽孢杆菌后的主要临床症状集中在脾脏、肝脏及法氏囊3个器官，引起器官发生出血肿胀，积液增多，本次分离的蜡样芽孢杆菌对雏鸡的半数致死量为5.01×107cfu/mL，说明该菌的致病性不太强，所以引起的临床症状主要以产蛋量减少，蛋鸡零星死亡，若感染强毒株可能症状更加明显。这些结果提示，在使用蜡样芽孢杆菌在作为益生菌使用时，应该更加要注重其安全性能的检测。

4 结 论

本实验室从发病蛋鸡体内首次分离到一株鸡源致病性的蜡样芽孢杆菌，半数致死量为5.01×107cfu/mL，患病鸡主要病理变化为肝脏肿大、质地变脆并伴有出血点，脾脏肿大，法氏囊透明化且内充满乳白色液体，盲肠端充气等，为蜡样芽孢杆菌的研究提供新的理论依据。