绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

郝志云，王继卿，罗玉柱，胡 江，刘 秀，李少斌

(甘肃农业大学 动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室/甘肃省牛羊基因改良工程实验室，兰州 730070)

Wnts(Wingless-type MMTV integration site family member)是一种分泌蛋白质，通过细胞表面受体介导的信号途径来调节生命活动。它主要通过经典和非经典Wnt途径发挥作用，其经典途径主要负责调节转录因子β-连环蛋白(β-catenin)和亚细胞定位。非经典途径除了激活Wnt/Ca2+信号途径以外，还通过Ca2+/钙调蛋白依赖性(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CamK II)蛋白激酶和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)影响细胞迁移及细胞黏附，同时依赖细胞极性(planar cell polarity, PCP)途径，通过激活JNK/ROCK调控细胞的生命活动。WNT5A(Wnt family member 5A)蛋白是Wnt非经典途径的代表，当它与细胞膜受体结合后，通过WNT、PCP及WNT/Ca2+信号通路将信号传递到细胞核内，激活下游的信号分子(JNK、CaMK II、PKA等)，进而调控细胞的生长、形态变化、骨架重排及极性等过程[1-2]。目前，关于WNT5A基因的研究主要集中于乳腺形态发生、毛囊发育、乳腺癌、肿瘤等方面。在小鼠乳腺发育中，WNT5A可以抑制乳腺导管的延伸和侧向分支。Roarty等[3]采用Elvax缓慢递送法[4]分别在小鼠乳腺脂肪垫中植入WNT5A与WNT5A-/-蛋白颗粒，结果发现，WNT5A-/-的乳腺组织具有较快的发育能力，主要表现为具有较大的末端芽、伸长的导管和增加的导管分支及其增殖。同时，WNT5A基因也能够抑制毛囊毛干的生长。李瑶等[5]在鹅胚胎期皮肤中研究发现，高表达的WNT5A抑制了次级毛囊的发育。随着WNT5A表达量的降低，次级毛囊的深度不断增加。研究还发现，WNT5A基因调节了孕体着床及妊娠期发育，在孕体滋养外胚层，它以Rho激酶依赖的方式增加了滋养细胞的运动和迁移[6]。然而，在家畜中，WNT5A仅在绵羊孕体着床中有较少研究，其它方面未有相关报道。

为了深入研究WNT5A基因的结构特征以及在不同组织中的表达情况，本研究以高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肃高山细毛羊为研究对象，在两个绵羊品种的泌乳高峰期(产后第21天)，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织，应用RT-PCR及生物信息学方法，克隆了绵羊WNT5A基因的CDS序列，分析核苷酸和氨基酸的序列和结构特征，检测该基因在乳腺等9个组织中的基因表达规律，以期为阐明WNT5A基因的生物学功能提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品采自于甘肃天祝县松山镇金子河绵羊繁育场。选择高泌乳量的小尾寒羊和低泌乳量的甘肃高山细毛羊各3只，均为健康无病、体重接近3岁、第4胎。当其处于泌乳高峰期(产后第21天)时，屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤各0.5 g左右。组织样用DEPC水冲洗完后装入2 mL冻存管，然后立即投入液氮中保存，带回实验室后于-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

按照Trizol Reagent(Invitrogen, CA, USA)说明书要求，提取组织中的总RNA。提取后的RNA用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用超微量分光光度计检测OD260/OD280及其浓度，质检合格的RNA保存于-80 ℃冰柜中备用；根据Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent(with gDNase)说明书要求，对RNA进行反转录，得到的cDNA稀释成100 ng/μL溶液，-20 ℃保存备用。

1.3 WNT5A基因引物设计及克隆

以普通牛(Bostaurus)的WNT5A基因序列(NM_001205971)作为模板，在绵羊基因组(Oar_v3.1)中进行同源性搜索，根据相似性最高的序列，设计引物P1和P2，其中P1用于WNT5A基因CDS区的克隆，P2引物用于后续的RT-qPCR分析，β-actin基因作为内参引物，引物具体信息见表1。以乳腺组织的cDNA作为模板，采用20 μL反应体系扩增绵羊WNT5A基因的CDS区序列，包括cDNA 0.8 μL(约100 ng/μL)，5 U/μL Taq预混酶10 μL，0.25 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测后,选择目的条带进行切胶、纯化回收并连接到质粒克隆载体pMD19-T上，经转化、PCR鉴定后挑取阳性单克隆穿刺培养，送至陕西杨凌天润奥科生物科技有限公司进行测序。

表1 绵羊WNT5A基因的引物信息Table 1 Primer information for sheep WNT5A gene

1.4 WNT5A生物学信息学分析

利用NCBI查找该基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，并用Blast进行验证；利用MEGA 5.0构建物种进化树；用ExPasy站点上的ProtParam软件分析绵羊WNT5A蛋白的理化性质；利用NetPhos 2.0(http://cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测WNT5A蛋白的磷酸化位点，利用NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测WNT5A蛋白的糖基化位点；采用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)在线进行三维建模，然后用Pymol输出蛋白质模型；利用String在线分析WNT5A蛋白的网络互作关系。

1.5 WNT5A基因的表达量分析

应用相对定量SYBR Green I(Takara, Dalian, China)染料法，在Applied Biosystems QuantStudio6 Flex仪(Temerlife, USA)中检测WNT5A基因的组织表达量。采用20 μL的RT-qPCR体系，包括：cDNA模板2 μL(<100 ng),0.25 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、10 μmol/L SYBR qPCR Master Mix 10 μL和RNase-free ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，59 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。溶解反应：95 ℃变性15 s,60 ℃采集荧光信号60 s。待反应结束后，分析反应的荧光定量溶解曲线，判断是否存在引物二聚体，以及PCR产物的准确性，收集数据，采用2-ΔΔCt法计算表达量[7],利用SPSS 19.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 WNT5A基因的克隆

以小尾寒羊的乳腺cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现目的片段大小跟预期结果一致(图1)。经过克隆测序后，获得完整的CDS区序列，大小为1 062 bp，编码353个氨基酸。

图1 绵羊WNT5A基因CDS区序列扩增产物检测结果M. 1 kb DNA ladder D-1040(Bioneer);1. PCR productFig.1 The results of sequence amplification products of sheep WNT5A gene CDS region

通过Blast分析发现，克隆获得的片段序列与山羊的WNT5A具有较高的序列同源性(98.7%)，与普通牛WNT5A之间的同源性为88.96%。基于GenBank中山羊(Caprahircus)、猪(Susscrofa)、普通牛(Bostaurus)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)和人类(Homosapiens)WNT5A的氨基酸序列，结合本研究获得的绵羊序列，构建了系统进化树。结果表明，本研究克隆所得序列首先与山羊的WNT5A序列聚到一支。由此说明，本研究中获得的序列为绵羊的WNT5A序列(图2)。

2.2 WNT5A蛋白的理化性质

绵羊WNT5A蛋白的原子组成为C1689H2658N494O503S27，分子质量为38798.31，等电点为9.02。WNT5A蛋白含有20种氨基酸，其中Ala含量最高(9.6%)，His含量最低(1.7%)。WNT5A的消光系数在280 nm时为58 870，不稳定系数为43.68，说明该蛋白是一个不稳定蛋白。WNT5A在哺乳动物网织红细胞内半衰期为30 h，脂肪系数为71.36，总平均亲水性为-0.283，说明该蛋白是一个疏水蛋白。磷酸化位点预测发现该蛋白质包含31个磷酸化位点，主要以丝氨酸(19)为主，还有苏氨酸(6)和酪氨酸(6)磷酸化位点。糖基化位点分析发现，WNT5A蛋白存在3个N-连接的糖基化修饰位点，分别是第114、120和326位天冬酰胺残基的酰胺氮原子。

绵羊WNT5A蛋白的二级结构由45.04%(159个)的无规则卷曲(Coil)、40.79%(144个)的α-螺旋(Helix)、9.63%(34个)的延伸链(Extenden strand)和1.53%(16个)的β转角(Turn)组成(图3)。总体来看，该蛋白的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主，延伸链和β转角则贯穿于整个蛋白质结构中，由此判断该蛋白质的二级结构为混合型。利用Swiss Model软件分析了WNT5A蛋白的三级结构，发现该蛋白的三级结构是由α-螺旋、无规则卷曲、β转角及延伸链互相折叠形成的简单空间构象。

图2 WNT5A氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of the amino acid sequence of WNT5A

图3 WNT5A蛋白质的空间结构蓝色的线表示α-螺旋，绿色的线表示β-转角，红色的线表示延伸链，浅红色的线代表无规则卷曲Fig.3 Spatial structure of WNT5A protein The blue line represents α-helix. The green line represents β-turn, the red grey line represents extended strand and the light grey line represents random coil

蛋白互作分析结果表明，WNT5A与卷曲蛋白受体(Frizzled, FZD)、低密度脂蛋白相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)及受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RYK)有互作关系(图4)。

2.3 WNT5A基因的组织表达特征分析

应用RT-qPCR法，检测了小尾寒羊和甘肃高山细毛羊中WNT5A基因的组织表达情况。结果表明，WNT5A基因在采集的9个组织中均表达，并且其表达具有组织特异性。在小尾寒羊中，WNT5A基因表达量由高到低的顺序依次为：皮肤>心脏>卵巢>乳腺>背最长肌>肾脏>肝脏>肺脏>脾脏；在甘肃高山细毛羊中，WNT5A基因的表达量由高到低的顺序依次为：皮肤>心脏>背最长肌>乳腺>肺脏>肾脏>肝脏>脾脏>卵巢。其次WNT5A的表达也呈现出品种特异性，WNT5A在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05)，在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05)，而在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)(图5)。

图4 绵羊WNT5A蛋白网络互作图Fig. 4 The protein interaction network of WNT5A protein sheep

3 讨 论

WNT5A作为非经典Wnt信号通路配体之一，在细胞的增殖、凋亡和分化等多个过程中发挥了重要作用。在WNT5A基因敲除的转基因小鼠中，β-catenin蛋白的表达量明显增高，表明在机体发育过程中WNT5A可能通过促进β-catenin的降解，从而>抑制了Wnt/β-catenin信号[8]。本研究采用RT-PCR技术克隆了WNT5A基因的CDS区序列，经Blast比对后发现，绵羊的WNT5A序列与山羊的序列具有高度同源性，表明该蛋白具有较高的保守性。绵羊WNT5A包含31个磷酸化位点和3个N-连接的糖基化修饰位点，这与WNT5A在生物体中复杂的生物学功能相符。磷酸化是生物体最普遍的修饰方式之一，广泛存在于生物体内的各个方面，WNT5A通过磷酸化作用改变了自身的蛋白结构，进一步引起了自身蛋白质活性的变化，从而广泛参与了细胞增殖、凋亡及分化等过程。N-连接的糖基化修饰是蛋白质翻译后最普遍的修饰方式之一，糖基化修饰对调节蛋白质的生物学活性、参与信号转导、指导蛋白质的正确折叠及运输等方面有着重要的影响[9]。因此，通过糖基化作用，可以改变WNT5A多肽的构象，增加蛋白质的稳定性，对其发挥多重的生物学功能具有重要作用[10]。

图 5 WNT5A基因在小尾寒羊和甘肃高山细毛羊不同组织中的表达量以小尾寒羊心脏为对照组；不同小写字母表示同一绵羊群体不同组织间差异显著(P<0.05)Fig. 5 Expression of WNT5A gene in different tissues of Small-tail Han sheep and Gansu alpine merino sheepSmall-tail Han Sheep heart is the control;different small letters indicate significant difference in different tissues in the same sheep population (P<0.05)

String分析结果表明，WNT5A蛋白与FZD、LRP及RYK蛋白有互作关系。在细胞内，WNT5A通过与FZD和LRP5/6结合，激活Wnt非经典途径，致使β-catenin在胞质内积累，进入核内与Tcf/Lef形成转录复合物，通过激活下游靶基因，调控了细胞的生命活动[11-12]。研究发现，当细胞内存在ROR2受体的情况下，WNT5A主要通过糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)非依赖性途径促进β-catenin降解来抑制经典Wnt途径，进而抑制乳导管的发育及分支[13]。当细胞内不存在ROR2受体时，它可与RYK受体结合，能够增强乳腺上皮生长[14]。

RT-qPCR结果显示，WNT5A基因在绵羊的9个组织中广泛表达，并且具有明显的组织特异性和品种特异性。WNT5A基因的广泛表达可能与Wnt的多重生物学功能有关。研究发现Wnt信号通路广泛参与了机体的发育及生长过程[15-17,6]。本研究发现WNT5A基因在皮肤中的表达量最高，这说明Wnt信号通路对毛囊生长和发育具有至关重要的作用。Wnt/β-catenin途径被认为是毛囊周期维持不可或缺的通路[18]。在小鼠中，WNT5A基因抑制了次级毛囊生长发育，拮抗Wnt/β-catenin信号通路[19]。同时，该基因也在绵羊心脏中高度表达。研究发现，在小鼠心肌细胞中，WNT5A表达上调可以促进内皮祖细胞向心肌细胞分化[20]，同时WNT5A在心脏中的高表达可能对心肌细胞分化和心脏形成具有重要的作用[15]。另外，WNT5A表达量的高低还与人的心力衰竭有关[21]。WNT5A在绵羊的肺脏、肝脏、肾脏和脾脏组织中也表达。研究已发现该基因在小鼠肺脏内源性修复[22]、肝脏创伤修复[23]、肾脏纤维化[17]和骨髓造血细胞生成等[24]过程中也发挥了重要作用。

WNT5A的表达也呈现出品种特异性，WNT5A在甘肃高山细毛羊皮肤组织中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05)，这可能与两个品种的毛囊发育和被毛长度差异有关。在小鼠毛囊中研究发现，WNT5A基因的表达量随着毛囊生长而逐渐增多[25]。由于甘肃高山细毛羊是细毛羊品种，其毛囊的数量多于粗毛羊的小尾寒羊，造成甘肃高山细毛羊中WNT5A基因的表达量高于小尾寒羊。同时星懿展等[25]采用腺病毒介导方式，对小鼠触须毛囊进行了体外培养，发现WNT5A处理组毛囊的毛干伸出长度变短。由于甘肃高山细毛羊成年母羊的被毛长度低于小尾寒羊成年母羊[26]，造成甘肃高山细毛羊中该基因的表达量较高，这也与WNT5A可以抑制毛干生长的结论相一致[25]。

WNT5A基因在甘肃高山细毛羊乳腺组织中的表达量也高于小尾寒羊(P<0.05)，这与两个品种间的泌乳量差异有关。本实验室前期测定发现，小尾寒羊具有良好的产奶性能，产后30 d内的平均产奶量为1 357 g/d。相比之下，甘肃高山细毛羊同期的产奶量为853 g/d。前人研究已发现，WNT5A可以抑制乳腺导管的延伸和侧向分支[3]，而乳导管及侧枝的发育程度与产奶量呈正相关，因此WNT5A具有抑制泌乳量的作用[27]。WNT5A在小尾寒羊卵巢中的表达量高于甘肃高山细毛羊，这可能与两个品种间的产羔数差异有关。小尾寒羊是著名的多胎多羔品种，其平均产羔率为270%，而甘肃高山细毛羊一般为单胎单羔[28]。研究发现，WNT5A与孕体着床及妊娠期发育有关，子宫内膜的WNT5A以旁分泌的方式对孕体滋养外胚层起作用，以通过激活Rho-ROCK途径激酶的非经典Wnt信号通路，增加了滋养细胞的运动和迁移[6]。滋养层细胞主要负责为胎盘提供血液，以满足胎儿在生长发育过程中对氧气及营养物质的需求[29]。因此推测，WNT5A在小尾寒羊卵巢中有较高的表达量是为了保障多羔后代的存活和正常的生长发育。

WNT5A在甘肃高山细毛羊背最长肌中的表达量高于小尾寒羊，这可能与二者之间的肉质嫩度差异相关。肌纤维主要由快肌纤维和慢肌纤维组成，快肌纤维直径大于慢肌纤维。研究发现，有较高慢肌纤维比例和较低快肌纤维比例的肌肉具有较好的嫩度[30-31]。WNT5A/Ca2+与CaMK IIδ偶联可以促进肌肉的分化[16]，并在调控肌纤维类型方面发挥着重要作用[32]。通过逆转录病毒WNT5A感染鸡胚后，鸡翅快肌纤维增加而慢肌纤维减少[33]，说明WNT5A可以导致肌肉嫩度变差。因此推测，高表达的WNT5A导致了甘肃高山细毛羊中快肌纤维增加和肌纤维直径增大，最终使甘肃高山细毛羊的肌肉嫩度老于小尾寒羊。

4 结 论

本研究获得了绵羊WNT5A基因的CDS区全长序列，它是编码353个氨基酸的不稳定疏水蛋白。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明，WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。并且WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。