桑葚酒发酵工艺条件的优化研究

黄 彭 ，胡 森 ，舒 琳 ，秦 文 ，赖小娇 ，吴 芳 ，2

（1.宜宾学院质量管理与检验检测学部，四川 宜宾 644000；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625000）

桑葚又名桑乌、桑果、桑枣，属桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）桑种（Morus alba L.）[1]，含有丰富的营养成分，如糖类、胡萝卜素、VA、VB1、VB2、VC、有机酸、人体所需的18 种氨基酸，钙、磷、铜、锌等矿物质元素[2-3]，以及各种活性成分，如花青素[4-5]、多糖[6]、多酚[7]、白藜芦醇[8]，有“民间圣果”[9]、“中华果王”之美称[10]。在医学上，桑葚可增益肝肾、滋养血液产生益生因子，具有多种保健功能，可增强人体免疫力，促进新陈代谢，属药食同源植物，深受广大消费者喜爱[11-12]。宜宾气候温和，现有桑园3.2 万hm2，位居四川省第二[13-14]。桑果柔软多汁，采摘期较短，贮运中易损伤腐烂变质，造成巨大的经济损失，影响其产业可持续发展[15]。因此对桑果进行加工处理，减少果农经济损失，增强桑葚产品市场竞争力势在必行。本文以宜宾桑葚为原料，研究了桑葚酒发酵工艺条件，并对其芳香物质进行测定，获得桑葚酒的最佳发酵工艺，以期为桑葚酒的开发提供科学依据，为提高桑葚加工附加值和促进城乡经济发展提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

桑葚：购于宜宾安阜农贸市场；白砂糖：购于宜宾绿源超市；活性干酵母EC118、DV10 和KD：法国拉曼集团产品，购于上海杰兔工贸有限公司，固态发酵资源利用四川省重点实验室保藏。蛋白胨、琼脂，北京奥博星生物技术有限公司产品；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

5975C-7890A 型气相色谱-质谱联用仪，T6 型新世纪紫外可见分光光度计，TGL-16GB 型高速离心机，LDZX-75KBS 型高温湿热灭菌锅，JJ060387 型超净工作台，DH1008 型水浴锅，Hei-VAP Precision 型旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 清洗、榨汁

选择新鲜无病变无腐烂的桑葚，去果柄，清水洗净，打浆（固液比为 1∶1.5（g/mL））于 4 ℃保存备用[16]。

1.2.2.2 成分调整

添加焦亚硫酸钠调整SO2的浓度[17]，添加白砂糖调整糖含量，并用柠檬酸调整至pH 4.0，常温静止放置10 h。

1.2.2.3 酵母活化

取活性干酵母 EC118、DV10、KD 各 1 g，分别加入10 mL 2%葡萄糖溶液中，35 ℃恒温水浴40 min 溶化。移取1 mL 酵母液于100 mL 灭菌后的YPD 液体培养基（1%酵母膏，2%葡萄糖，2%蛋白胨，自然pH，在121 ℃下高压灭菌20 min）[18]中35 ℃恒温培养48 h后，采用显微镜计数，调整菌种数为1×107CFU/mL，置于4 ℃冰箱中备用[19]。

1.2.2.4 主发酵

接入活化好的酵母菌种液，恒温发酵7 d。

1.2.2.5 陈酿、过滤

原酒在15 ℃陈酿5 个月，经离心过滤除去酒中的胶体、蛋白质等成分，取上清液，制得桑葚发酵原酒[20]。

1.2.2.6 调配

根据桑葚发酵酒的酒精度、含糖量、总酸等指标，用桑葚发酵原酒、白砂糖和柠檬酸等进行调配，使之符合发酵酒的品质要求。

1.2.2.7 灭菌

调配后的桑葚发酵酒进行罐装，放入温度为70 ℃水浴锅中，杀菌30 min[21]。

1.2.2.8 冷却

冷却至室温后，放在阴凉通风处保存。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 发酵菌种的筛选

量取40 mL 桑葚果汁于250 mL 锥形瓶中，调整初始糖度为180 g/L，添加焦亚硫酸钠调整SO2浓度为70 mg/L，静置10 h 后，分别接种5%活化后的EC118、DV10、KD 酵母菌种液，置于25 ℃恒温培养箱中培养7 d 待发酵结束后，以桑葚发酵酒的残糖量和酒精度为指标，筛选出适合桑葚发酵的菌株，作为试验后续发酵用菌种。

1.2.3.2 酵母接种量对发酵的影响

量取40 mL 处理好的桑葚果汁于250 mL 锥形瓶中，用白砂糖调节桑葚汁初始含糖量为180 g/L，调整SO2含量为70 mg/L，静置10 h 后，分别接种3%、5%、7%、9%和11%活化好的KD 酵母菌种液，置于25 ℃恒温培养箱中发酵7 d。完成发酵后，以桑葚酒的酒精度和残糖量为指标，筛选出合适桑葚酒发酵的酵母接种量。

1.2.3.3 初始糖度对发酵的影响

量取40 mL 处理好的桑葚果汁于250 mL 锥形瓶中，用白砂糖分别调节桑葚汁初始含糖量分别为140、160、180、200、220 g/L，调整 SO2含量为 70 mg/L，静置10 h 后，接种活化后KD 酵母菌种，接种量为5%，置于25 ℃恒温培养箱中发酵7 d。完成发酵后，以桑葚酒的酒精度和残糖量为指标，筛选出合适桑葚酒发酵的初始糖度。

1.2.3.4 SO2浓度对发酵的影响

量取40 mL 处理好的桑葚果汁于250 mL 锥形瓶中，用白砂糖调节桑葚汁初始含糖量为180 g/L，分别调整 SO2浓度分别为 30、50、70、90、110 mg/L，静置10 h 后，接种活化后KD 酵母菌种，接种量为5%，置于25 ℃恒温培养箱中发酵7 d。完成发酵后，以桑葚酒的酒精度和残糖量为指标，筛选出合适桑葚酒发酵的SO2浓度。

1.2.3.5 温度对发酵的影响

量取40 mL 处理好的桑葚果汁于250 mL 锥形瓶中，用白砂糖调节桑葚汁初始含糖量为180 g/L，调整SO2浓度为70 mg/L，静置10 h 后，接种活化后酵母菌种，KD 接种量为 5%，分别置于 20、25、30、35、40 ℃恒温培养箱中发酵7 d。完成发酵后，以桑葚酒的酒精度和残糖量为指标，筛选出合适桑葚酒发酵的温度。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，选定初始糖度、SO2浓度、酵母接种量、发酵温度为主要影响因素，每个因素3个水平，以残糖含量和酒精度为考察指标，进行L9(34)正交试验[22]，正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 测定项目与方法

1.2.5.1 残糖量

采用3，5-二硝基水杨酸法[23]测定。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，获得总糖的标准曲线：y=1.09x-0.027，R2=0.995。

1.2.5.2 酒精度

使用100 mL 量筒量取50 mL 桑葚酒样品并倒入蒸馏瓶中，用50 mL 蒸馏水将量筒洗涤3 次，并将洗涤液全部加入蒸馏瓶中。打开冷凝水，加热至70 ℃开始蒸馏，用100 mL 容量瓶收集馏出液接近刻度线时，停止加热。再用全自动密度折光仪测定酒精度[24]。

1.2.5.3 香气成分

采用GC-MS 联用法进行检测[25-26]。色谱检测条件参考游玲等[27]的方法，使用Lzp930 色谱柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯 N2，升温程序：55 ℃保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升温至 150 ℃，保持 1 min，再以10 ℃/min 升温至 170 ℃，保持 3 min，再以 10 ℃/min升温至220 ℃，保持20 min。进样温度220 ℃，检测温度 250 ℃，进样量 0.4 μL，分流比 10∶1。质谱条件[28]：电子轰击离子源（EI），温度 230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；电子能量70 eV；扫描质量范围35~400 m/z。利用NIST 11.L 标准质谱库进行对比，按峰面积归一化法求得各成分相对质量分数。

1.2.5.4 感官品质评价

邀请食品专业的老师和接受过品酒技能培训的同学共10 名，对桑葚酒的色、香、味等进行综合感官评分，感官评分标准设计[29-31]如表2 所示。

表2 感官评分标准Table 2 Sensory evaluation criteria

1.2.6 数据处理

采用Excel 2016 和SPSS 24.0 软件进行统计分析和数据处理。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种对桑葚酒发酵的影响

菌种的品质直接影响桑葚酒的发酵效果，接种发酵7 d 后桑葚酒残糖量和酒精度如图1 所示，3 种菌种发酵桑葚的能力不相同，其中KD＞DV10＞EC110。KD 酵母发酵后的酒精度显著高于其余两株菌种（P＜0.05），EC118 和 DV10 菌种的酒精度差异不显著。KD 酵母发酵能力较强，其酒精度最高达到10.87%Vol，残糖量最低，为1.92 g/L。因此桑葚发酵的优势菌种为KD 酵母。

图1 不同菌种对桑葚发酵酒残糖量和酒精度的影响Fig.1 Effects of different strains on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.2 酵母接种量对桑葚酒发酵的影响

由图2 可见，当酵母接种量为3%时，发酵酒样品中的酒精含量低，残糖含量高达1.905 g/L，说明接种量偏少时，酵母细胞增殖缓慢，导致发酵进程缓慢，对发酵体系中糖等发酵基质的利用不高，发酵不彻底。酵母接种量为5%~7%时，残糖含量相对减小，其中当接种量为5%时，发酵酒样中酒精度达到最高（11.98%），这主要是随着接种量的增加，酵母细胞增殖迅速，发酵迅速，发酵系统糖消耗快，发酵过程温和，有利于酒精的积累和芳香物质的形成。接种量超过7%后，残糖量的变化相对小，酒精含量差异大，主要是因为当接种量大时，酵母细胞大量繁殖，发酵系统中的营养物质消耗迅速，不利于发酵过程中芳香物质的形成和积累，而且大量的代谢产物和次生代谢产物都会对发酵造成污染。所以选桑葚果酒发酵的酵母接种量为5%。

图2 酵母接种量对桑葚酒残糖量和酒精度的影响Fig.2 Effects of yeast inoculations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.3 初始糖度对桑葚酒发酵的影响

由图3 可知，在整个桑葚发酵过程中，随着初始糖含量的增加，桑葚酒中的酒精含量也随之增加。初始糖度为140~160 g/L 时，发酵后的残糖量相对较少，酒精度较低，酒味清淡，桑葚风味不明显；初始糖度为180 g/L 时，酒样酒精度较高，达到11.79%，酒体风味浓郁；当初始糖度为200 g/L 和220 g/L 时，残糖量相对较高，酒精度变化明显，酒体口感偏甜。说明偏高的初始糖度可能影响了酵母的生产代谢，抑制了发酵过程中酒精的积累。所以选桑葚果酒发酵的初始糖度为180 g/L。

图3 初始糖度对桑葚酒残糖量和酒精度的影响Fig.3 Effects of initial sugar contents on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.4 SO2 浓度对桑葚酒发酵的影响

适量SO2能够有效地抑制杂菌生长，促进果酒发酵顺利进行的同时还具有抗氧化等作用。但SO2过量不仅使酒的品质变劣，还易对人体健康造成危害[17]。由图4 可知，随着SO2浓度的增加，残糖量增加，酒精度整体呈下降趋势，并带有刺激性气味。可能是由于SO2的增酸作用，抑制了酵母菌株的生长，对糖的消耗能力减弱。当SO2浓度为30 mg/L 时，桑葚酒中残糖含量最低，酒精度数最高，酒香较浓郁，且刺激性气味可以忽略不计。所以选择SO2浓度为30 mg/L 作为桑葚酒发酵的添加浓度。

图4 SO2 添加量对桑葚酒残糖量和酒精度的影响Fig.4 Effects of SO2 concentrations on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.5 发酵温度对桑葚酒发酵的影响

适宜的发酵温度对酵母的活性及香味物质形成具有重要作用。当温度较低时，酵母生长快，但发酵速度慢，导致发酵周期延长；当温度较高时，发酵速度快，但容易损失香味物质[32]。如图5 所示，当发酵温度低于25 ℃时，由于酵母细胞生长缓慢，糖利用率低，导致酒精积累少而残糖量高；当温度超过25 ℃时，酵母生长可能受到抑制，导致发酵动力不足，残糖量高酒精度低，香味物质降低；当温度控制在25 ℃时，发酵效果好，发酵过程平稳且彻底，残糖量最低，为1.65 g/L，酒精度最高，为11.57%。所以选择25 ℃为桑葚酒的发酵温度。

图5 发酵温度对桑葚酒残糖量和酒精度的影响Fig.5 Effects of fermentation temperatures on residual sugar content and alcohol content of mulberry wine

2.6 正交试验结果

由表3 可见，以酒精度为考察指标，影响桑葚酒发酵工艺各因素的主次顺序为：A＞C＞B＞D；最佳发酵工艺条件为A2B2C3D2，即初始糖度180 g/L，酵母接种量5%，SO2浓度40 mg/L，发酵温度25 ℃。以感官品质为考察指标，影响桑葚酒发酵工艺各因素的主次顺序为：D＞A＞B＞C；最佳发酵工艺条件为A2B2C3D3，即初始糖度180 g/L，接种量5%，SO2浓度40 mg/L，发酵温度27 ℃，由于D2和D3的感官品评分差异不显著（P=0.876＞0.05），在实际操作中可忽略其影响，因此温度选择25 ℃。在A2B2C3D2条件下进行3 次验证试验，制得桑葚酒感官品质得分为81.7±1.24 分，酒精度为12.09%±0.16%，色泽明亮、无异杂味；风格良好，具有桑葚独特的滋味，更容易让人接受。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal test results

2.7 香气成分检测结果

利用GC-MS 法对最优条件下发酵的桑葚酒进行香气成分分析，得离子峰图6。由图6 可以看出，各挥发性物质的保留时间差异很大，大部分物质在1~10 min 内出现，其中甲醇、乙醛、乙醇等主要集中在5 min 左右，异戊醇、糠醛等的保留时间相对较长，在14 min 后。

图6 离子峰图Fig.6 Diagram of ion peak

由表3 可见，检测出相对质量分数大于1%的化合物共11 种，这些物质的存在，赋予了桑葚酒特有的香气与风味。其中乙醇的含量最高，甲醇和两种酯类物质相对含量较少；酯类物质赋予桑葚酒果香、花香；苯乙醇和异丁醇的含量相对较高，其中苯乙醇属于芳香醇类，是酵母的代谢产物，其感官阈值相对较低，所以香气值很高[33]，它们为桑葚酒提供了特殊的风味。

表3 香气成分检测结果Table 3 Test results of aromatic substances

3 结论

本研究以宜宾本地产刺桑葚为原料，经单因素试验和正交试验优化桑葚发酒工艺条件。结果表明，桑葚酒最佳发酵工艺条件为：初始糖度180 g/L，KD 酵母接种量5%，SO2浓度40 mg/L，发酵温度25 ℃，发酵时间7 d。在此工艺条件下发酵出的桑葚酒，酒精度为12.09%±0.16%，感官得分81.7±1.24 分。利用GC-MS 联用检测出发酵酒主要香气物质为：醇类6种，醛类3 种，酯类2 种，这些化合物赋予了桑葚酒独特的风味。