黄连类寒热药对体外抗流感病毒的影响

俞程玲，吴巧凤

(浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,其发病率、死亡率及造成的经济损失均位列各种传染病之首［1］。中医药防治流感历史悠久,优势独特,具有辨证施治,不易耐药等特点,中药可通过多成分、多途径、多靶点、多效应地发挥抗流感药效［2］。流感在中医属温病范畴,并倡导“寒热并用” 的治则［3］。黄连为典型的苦寒中药,黄连及其主要活性成分盐酸小檗碱均具有显著的抗流感病毒作用［4-5］,黄连也常以寒热配伍的方式出现在黄连香薷饮,半夏泻心汤和苏叶黄连汤等诸多方剂中［6-8］,黄连亦可与诸多热性和温性中药(如干姜、厚朴等) 配伍形成寒热药对,并作为最小的复方发挥疗效［9-12］。项目组前期发现,黄连类寒热药对黄连-干姜,黄连-紫苏叶和黄连-厚朴［6］均具有抗流感病毒作用,且药对的抗流感药效优于单味药。但黄连类寒热药对抗流感作用的系统研究未见报道。本文通过查阅含黄连类寒热药对的古方,采用Apriori 关联规则分析法筛选与黄连关联度较高的热,温性中药,配伍成寒热药对,进一步采用细胞病变效应(CPE) 与MTT 法,以流感病毒抑制率为评价指标,考察黄连类寒热药对的体外抗流感病毒作用强弱,筛选抗流感病毒作用最强的药对,为含黄连类寒热药对的复方的临床应用及流感治疗提供参考。

1 材料

1.1 药物与试剂 黄连(四川,批号20170501) 为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.的干燥根茎,半夏(浙江,批号20180701) 为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.,厚朴(浙江,批号20180701) 为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRend.Et Wils.的干燥干皮、根皮和枝皮,附子(四川,批号20180301) 为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品,肉桂(广西,批号20180601) 为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥树皮,吴茱萸(浙江,批号20180701) 为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果实,紫苏叶(浙江,批号20171001) 为唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.) Britt.的干燥叶(或带嫩枝),干姜(四川,批号20171101) 为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎,所有药材均购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室张水利教授鉴定为正品。磷酸奥司他韦胶囊(瑞士罗氏有限公司,批号M1025)；MEM 培养液(批号1898620)、胎牛血清(批号1808455)、谷氨酰胺(批号1677185)、0.25% EDTA-胰酶(批号1846496)、PBS (批号1864553)、青/链霉素母液(批号92SLBB76) 均购自美国Gibco 公司。

1.2 仪器 705 型-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo 公司)；A2 型生物安全柜(美国Thermo 公司)；3111 型CO2恒温培养箱(美国Thermo 公司)；R-4100 型酶标仪(美国Dynatech 公司)；DC-300 型倒置显微镜(德国Leica 公司)。

1.3 病毒和细胞株 甲型流感病毒A/PR/8/34 鼠适应株(H1N1) 及MDCK 细胞株均由浙江省疾病预防控制中心病毒所提供,于-80 ℃冰箱超低温保存。流感病毒株经鸡胚传代后,经测定血凝效价为1 ∶1 024。

2 方法

2.1 黄连类寒热药对数据库建立 从中国方剂数据库中搜索出含有黄连类寒热药的方剂共193 首,排除标准为单味药方剂、组成重复的方剂、未含黄连类寒热药对的方剂,数据录入Microsoft Excel 2010 软件中。为确保数据的准确性,必须进行双人核对。

2.2 数据分析 采用Excel 2010、SPSS Modeler 18.0 软件,对数据库中的数据进行Apriori 关联规则分析。

2.3 药液的制备 检索文献中各药对的临床常用配比发现,黄连-半夏药对为1 ∶1 和1 ∶3［13］,黄连-紫苏叶药对为1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1 和4 ∶1［14］,黄连-干姜药对为1 ∶1和1 ∶3［13］,黄连-附子药对为2 ∶1、3 ∶2、2 ∶3、1 ∶1 和4 ∶1［15］,黄连-肉桂药对为10 ∶1、4 ∶1和2 ∶1［16］,黄连-吴茱萸为1 ∶1、2 ∶1 和6 ∶1［17］,黄连-厚朴药对为1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1 和2 ∶3［18］。结合文献数据,经预实验及前期研究结果,确定黄连-厚朴［19］、黄连-半夏、黄连-紫苏叶、黄连-干姜、黄连-附子、黄连-肉桂和黄连-吴茱萸各药对配比分别为1 ∶1、1 ∶3、1 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、10 ∶1 和6 ∶1时体外抗流感作用最强。取上述配比的药对及单味药(黄连、半夏、紫苏叶、干姜、附子、肉桂、吴茱萸和厚朴),各加10 倍量水回流提取2 次,每次1 h,合并提取液,浓缩至相当于含生药量0.4 g/mL,即得相应提取药液,4 ℃冷藏。临用时,用PBS 稀释至所需浓度。

2.4 药物对MDCK 细胞毒性的测定 将黄连类寒热药对及各单味药提取液倍比稀释成9 个质量浓度(25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.781、0.391、0.195、0.098 mg/mL),分别加至96 孔细胞培养板(浓度约1.5×105/mL,下同)中,每孔100 μL,平行设4 个复孔,同时设正常细胞对照组,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,于倒置显微镜下逐日观察各组的细胞形态,48 h 后终止培养,观察各组的细胞病变效应(CPE)。

2.5 流感病毒半数细胞感染量（TCID50） 的测定 取贴壁且长成单层的96 孔细胞培养板,PBS 轻洗2～3 次。取流感病毒原液用细胞维持液以10 倍比梯度稀释,稀释液浓度为10-1～10-8。取不同浓度的病毒稀释液,以每孔100 μL 依次接种于细胞(每个浓度稀释液平行设置8 个复孔),设置正常对照组(只加细胞维持液,不加流感病毒)。将接毒后的培养板置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养,待流感病毒感染细胞1 h 后弃病毒液,PBS 轻洗2～3 次,加入细胞维持液(每孔100 μL),常规培养72 h［20-21］,并于倒置显微镜下逐天观察细胞病变效应(CPE),记录各孔细胞病变状况及孔数。采用Reed-Muench 法,计算流感病毒半数细胞感染量(TCID50)。

2.6 药物对流感病毒感染MDCK 细胞活性的影响 取细胞维持液将黄连类寒热药对及各单味药提取液倍比稀释成3 个浓度梯度,与50TCID50的流感病毒液等体积混合,将药液与病毒混合液接种于MDCK 细胞培养板中,100 μL/孔,各浓度设3 个平行复孔,设置阳性对照组(每孔加100 μL 0.01 mg/mL 奥司他韦稀释液)、病毒对照组(每孔加100 μL的病毒生长液) 和正常对照组(只加细胞维持液),置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h,每孔加20 μL 的MTT试剂,培养4 h 后加入150 μL/孔的DMSO,振荡10 min,酶标仪于490 nm 波长处测定各孔的OD490,并计算药物对病毒的抑制率,公式如下。

2.7 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件进行处理,结果以() 表示,各组数据先进行正态性检验和方差分析,若符合正态分布和方差齐性,则采用ANOVA 分析；若方差不齐性,则进行非参数秩和检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 Apriori 关联规则分析 使用SPSS Modeler 18.0 软件对193 首含黄连类寒热药对的方剂中黄连与热、温性中药进行关联规则挖掘,构建“数据源→类型→Apriori→网络”的关联规则数据流,并设置条件(支持度≥15.0%,置信度≥90%,前项数≤2),得到药物关联规则7 条。由表1、图1 可见,与黄连高频配伍的热、温性中药分别是半夏、厚朴、附子、肉桂、吴茱萸、紫苏叶和干姜,故确定黄连-半夏、黄连-厚朴、黄连-附子、黄连-肉桂、黄连-吴茱萸、黄连-紫苏叶、黄连-干姜作为研究对象。

表1 黄连类寒热药对的关联规则分析

图1 黄连类寒热药对的关联规则网状图

3.2 药物对MDCK 细胞的毒性测定结果 由表2 可知,黄连、肉桂、吴茱萸、半夏、附子、紫苏叶、干姜、厚朴最大无毒质量浓度分别为0.391、0.39、0.39、1.56、3.125、6.25、6.25、12.5 mg/mL。由表3 可知,黄连-半夏,黄连-厚朴,黄连-附子,黄连-肉桂,黄连-吴茱萸,黄连-紫苏叶、黄连-干姜最大无毒质量浓度分别为1.56、6.25、1.56、0.195、0.195、0.781、1.56 mg/mL,对细胞的毒性依次为黄连-吴茱萸=黄连-肉桂＞黄连-紫苏叶＞黄连-半夏=黄连-附子=黄连-干姜＞黄连-厚朴,即黄连-厚朴药对的细胞毒性最小。

表2 单味药的最大无毒浓度（n=4）

表3 黄连类寒热药对的最大无毒浓度（n=4）

3.3 细胞半数感染量（TCID50） 的测定结果 根据病毒感染MDCK 细胞引起的细胞病变情况,采用Reed-Muench 法测得细胞半数感染量TCID50为1.0×10-4.1/0.1 mL。

3.4 对流感病毒感染的MDCK 细胞活性的影响 由表4 可知,在细胞最大无毒质量浓度范围内,7 个药对对流感病毒的抑制率均随其质量浓度的增大而递增,即抗病毒活性逐渐加强,呈现显著的量效关系。在最大无毒质量浓度时,黄连-半夏、黄连-厚朴、黄连-附子、黄连-肉桂、黄连-吴茱萸、黄连-紫苏叶、黄连-干姜对流感病毒的抑制率分别为 39.33%、69.18%、43.57%、52.19%、60.00%、67.54%、61.23%,与病毒对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。黄连、厚朴、干姜、紫苏叶、肉桂、附子、吴茱萸、半夏单味药在最大无毒质量浓度时对流感病毒的抑 制率分别 为 37.67%、33.95%、49.05%、61.72%、32.57%、40.62%、44.71%、34.76%,与病毒对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。综上所述,各药对的抗流感病毒作用均优于配伍的两单味药。

4 讨论

关联规则挖掘可从数据背后发现事物之间可能存在的关联,适用于在大量方剂中挖掘潜在的药物组合,其中Apriori 算法是关联规则中最经典和最有影响力的算法,其余算法(DHP 算法,Partition 算法和Samping 算法等) 大多以Apriori 算法为核心,是Apriori 算法的变体或扩展［22-23］。本文采用关联规则挖掘,结合Apriori 算法对含黄连类寒热药对古方中黄连和热,温性中药进行关联性分析,挖掘隐含的用药规律,结果显示,半夏,厚朴,附子,肉桂,吴茱萸,紫苏叶和干姜等7 味中药与黄连关联度较高,且黄连-半夏、黄连-厚朴、黄连-附子、黄连-肉桂、黄连-吴茱萸和黄连-紫苏叶均为经典的黄连类寒热药对［22-25］,与Apriori 关联性分析结果一致。据报道,厚朴丸、黄连香薷饮和连朴饮等经典方均包含黄连-厚朴药对,厚朴丸和连朴饮临床常用于治疗脾胃疾病,而黄连香薷饮(仅有黄连、厚朴和香薷组成) 用于治疗暑湿感冒、时疫感冒等症状,项目组首次发现其具有抗H1N1 流感病毒作用,且拆方研究显示,黄连-厚朴药对的抗流感药效优于全方及各单味药［6］。6 个经典方如半夏泻心汤(含黄连-半夏)、附子汤(含黄连-附子)、交泰丸(含黄连-肉桂)、左金丸(含黄连-吴茱萸)、苏叶黄连汤(含黄连-紫苏叶) 和乌梅丸(含黄连-干姜) 常用于脾胃疾病的治疗,其中半夏泻心汤和附子汤也可用于治疗外感病［26-29］,但6 个方剂(包括各所含的黄连类寒热药对) 的抗流感作用研究未见报道。本文研究显示7 个黄连类寒热药对均有体外抗流感病毒作用,且黄连-厚朴药对的抗流感病毒作用最强。

表4 黄连类寒热药对对流感病毒感染MDCK 细胞活性的影响（， n=3）

表4 黄连类寒热药对对流感病毒感染MDCK 细胞活性的影响（， n=3）

注:与病毒对照组比较,**P＜0.01。

药对的配伍比例不同,将导致药效的差异。本文根据7 个药对的文献常用配比［13-19］,并结合抗流感预实验,确定各药对抗流感作用的最佳配比(黄连-半夏、黄连-紫苏叶、黄连-干姜、黄连-附子、黄连-肉桂和黄连-吴茱萸的配比分别为1 ∶3、1 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、10 ∶1、6 ∶1),这些配比均为临床常用经方中的经典配比之一,体现了经典方剂中药对配比的科学性。根据此配比进一步考察各药对的抗流感作用强弱,较为科学。

本实验采用MTT 法比较了7 个黄连类寒热药对体外抗流感病毒作用的强弱,确定黄连-厚朴为抗流感药效最佳的黄连类寒热药对,为下一步继续开展体内抗流感作用研究奠定了基础,也可为含黄连类寒热药对复方的临床应用及流感治疗提供参考。