延胡索乙素聚乳酸纳米粒的制备及其体内药动学研究

荆 玲，范炎峰，邹梦梦，刘宽浩

(1.黄河科技学院，河南 郑州 450063；2.郑州市第六人民医院，河南 郑州 450000）

延胡索乙素是从罂粟科紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 中提取出的生物碱成分［1］,具有镇痛、降血压、抗心律失常、抗肿瘤等多种药理活性［2］。但该成分体内不稳定［3］,体外溶出低,水溶性差,口服吸收的生物利用度不理想(仅为6.59%)［4］,导致临床应用受限。

随着人类活动增加及外来物种入侵,延胡索生长环境恶化,进而濒临灭绝［5］,故提高该资源使用效率及生物利用度具有重要意义,目前已有将其制成自微乳、脂质体的报道［6-7］。其中,自微乳虽可显著促进药物吸收,但处方中需加入大量表面活性剂,具有潜在溶血风险［8］；脂质体虽可保护药物不被降解,提高药物体内稳定性、生物利用度,但存在包封率较低、贮存稳定性差等缺点［9］。

聚合物纳米粒能有效控制药物释放,提高稳定性,改善生物利用度,正日益受到相关学者的关注。聚乳酸作为药物辅料被收录进《美国药典》,是纳米给药系统的载体,与难溶性药物制成纳米粒后可显著促进后者体内吸收,提高其生物利用度［10-14］。本实验采用改良的自乳化溶剂扩散法制备延胡索乙素聚乳酸纳米粒,对其基本性质、体外溶出进行研究,并考察体内药动学,以期为相关口服制剂的开发提供依据。

1 材料

AR2240 型电子天平［梅特勒托利多仪器(上海) 有限公司］；U3000 型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；MYP13-2S 型磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；JC-220A 型氮气吹扫仪(浙江创聚环保有限公司)；UVS-1 型涡旋振荡器(北京优晟联合科技有限公司)；Millipore 超滤离心管(南京裕成实验设备有限公司)；TENLIN型实验室超声波细胞粉碎机(江苏天翔仪器有限公司)；Master-sizer 型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)。

延胡索乙素原料药 (批号180615,纯度98.0%,上海中药制剂有限公司)；延胡索乙素对照品(批号110726-201604,纯度99.2%,中国食品药品检定研究院)。聚乳酸(PLA,相对分子质量15 000,批号171013,上海市协泰化工有限责任公司)。透析袋(美国Sigma 公司,分子量8～14 kDa)；泊洛沙姆188 (批号WPE1566D,德国BASF 公司)。SD 大鼠,雌雄兼具,体质量约为300 g,购于河南省实验动物中心,动物生产许可证号SCXK (豫) 2016-0002。

2 方法与结果

2.1 延胡索乙素聚乳酸纳米粒制备 取延胡索乙素30 mg、聚乳酸450 mg,加到30 mL 有机溶剂(乙醇-丙酮比例1 ∶1) 中,超声溶解,作为有机相；配制泊洛沙姆188 溶液(5 g/L) 80 mL,作为水相,在磁力搅拌下将有机相缓慢滴到水相中,恒温搅拌15 min 后在40 ℃下减压旋蒸30 min (每2 min排气1 次),除去有机溶剂,立即置于冰水混合物中固化15 min,补充水相至80 mL,即得。同法制备不加延胡索乙素的空白纳米粒混悬液。

2.2 延胡索乙素含量测定

2.2.1 色谱条件 Thermo C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈-0.1%乙酸(三乙胺调pH 值至6.0)(55 ∶45)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长281 nm；进样量10 μL。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取延胡索乙素聚乳酸纳米粒1.0 mL,置于25 mL 量瓶中,丙酮超声处理2 min,静置至室温后流动相定容至刻度,12 500 r/min 离心10 min,取上清液,即得。

2.2.3 线性关系考察 称取延胡索乙素对照品10 mg,溶于10 mL 乙腈中,得到1 000 μg/mL 贮备液,精密量取2.5 mL,置于50 mL 量瓶中,流动相定容,得到50 μg/mL 对照品溶液,流动相依次稀释至25.0、12.5、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.2.1” 项色谱条件下各取10 μL 进样测定。以延胡索乙素质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,得方程为Y=2.108 5X+0.100 9 (r=0.999 7),在0.05～25.0 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.4 方法学考察 取供试品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,测得延胡索乙素峰面积RSD 为0.62%,表明溶液在 24 h 内稳定性良好。取 25.0、12.5、0.05 μg/mL对照品溶液,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得延胡索乙素峰面积RSD 分别为0.26%、0.21%、0.38%,表明仪器精密度良好。按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,测得延胡索乙素峰面积RSD 为0.83%,表明该方法重复性良好。精密量取4 mL “2.2.3” 项下贮备液,置于10 mL 量瓶中,乙腈定容,得到400 μg/mL 对照品溶液。取1.0 mL 空白纳米粒混悬液,置于25 mL量瓶中,加入上述对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL后丙酮超声处理2 min,流动相定容至刻度,在“2.2.1” 项色谱条件下各进样测定6 次,测得延胡索乙素平均加样回收率分别为99.59%、100.31%、100.05%,RSD 分别为0.64%、0.82%、1.24%。

2.3 包封率、载药量测定 精密量取1.0 mL 延胡索乙素聚乳酸纳米粒混悬液,置于超滤离心管(10 kD) 中,12 500 r/min 离心20 min,取滤液,HPLC 法测定游离延胡索乙素量(m游离)；精密量取延胡索乙素聚乳酸纳米粒1.0 mL,置于25 mL量瓶中,丙酮超声处理2 min,静置至室温后流动相定容,12 500 r/min 离心10 min,HPLC 法测定延胡索乙素总量 (m总),计算载药量、包封率,公式分别为载药量=［(m总-m游离)/m总脂质］ ×100%、包封率=［(m总-m游离)/m总］ ×100%,其中m总脂质表示纳米粒总质量,平行3 份,测定两者平均值分别为 (76.64 ± 0.23)%、(5.01 ±0.12)%。

2.4 延胡索乙素聚乳酸纳米粒表征

2.4.1 Zeta 电位、粒径 取延胡索乙素聚乳酸纳米粒混悬液100 μL,置于2 mL 蒸馏水中,测定其Zeta 电位、粒径,结果见图1～2。由此可知,3 批纳米粒平均Zeta 电位为(-11.1±1.5) mV,粒径为(176.18±5.21) nm,PDI 为0.081±0.011。

图1 延胡索乙素聚乳酸纳米粒Zeta 电位Fig.1 Zeta potential of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

图2 延胡索乙素聚乳酸纳米粒粒径分布Fig.2 Particle size distribution of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.4.2 形态 取适量延胡索乙素聚乳酸纳米粒混悬液,滴加至碳膜的铜网上,1.0% 磷钨酸染色,干燥后置于透射电镜(TEM) 下观察其形态,结果见图3。由此可知,纳米粒粒径与粒度分析仪测定结果基本一致,它基本呈球形,之间无粘连。

图3 延胡索乙素聚乳酸纳米粒TEM 图Fig.3 TEM image for tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.5 冻干粉制备及表征 取3 mL 延胡索乙素聚乳酸纳米粒混悬液,置于西林瓶中,加入3%甘露醇作为冻干保护剂,振荡混匀,置于-55 ℃冷冻干燥机中预冻48 h 后抽真空,6 h 内升温至-20 ℃后保持12 h,3 h 内升温至0 ℃后保持2 h,3 h 内升温至25 ℃后保持12 h,即得,密封。冻干粉复溶后,测得其平均粒径为(226.91±7.81) nm,Zeta 电位为(-7.5±1.2) mV,包封率下降至 (70.14±1.02)%,载药量为(4.23±0.23)%。

2.6 体外释药研究 取适量延胡索乙素聚乳酸纳米粒冻干粉末(含延胡索乙素20 mg),加入3 mL 1.0%SDS 溶液制成释放液,置于透析袋(分子量8 000～12 000 Da) 中,尼龙绳两端扎紧。以900 mL 1.0%SDS 溶液为释放介质,设置溶出仪温度为37 ℃,转速为100 r/min,于0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h 各取样3 mL,同时补加3 mL 1.0%SDS 溶液,另取适量延胡索乙素混悬液(分散于1.0% SDS 溶液中) 置于透析袋中,含药量均为20 mg,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图4。由此可知,原料药释放非常缓慢,12 h 内累积释放度仅为26.39%,12～36 h 内几乎无释放,可能与延胡索乙素水溶性差、药物颗粒较大有关；聚乳酸纳米粒在各时间点的累积释放度均高于原料药,体外释药与Weibull 模型拟合度最高(r=0.988 4),见表1。

图4 延胡索乙素体外释药曲线Fig.4 In vitro drug release curves for tetrahydropalmatine

表1 模型拟合结果Tab.1 Results of model fitting

2.7 体内药动学研究

2.7.1 分组、给药与采血 12 只大鼠随机分为2 组,每组6 只,给药12 h 前禁食不禁水,按20 mg/kg剂量分别灌胃给予延胡索乙素0.5%CMCNa 混悬液(2.0 mg/mL)、延胡索乙素聚乳酸纳米粒冻干粉溶液(2.0 mg/mL)。乙醚麻醉大鼠后,于0、0.25、0.5、1、2.0、2.5、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各约0.3 mL,3 000 r/min 离心2 min,血浆样品置于-20 ℃冰箱中保存。

2.7.2 血浆样品预处理 吸取大鼠血浆100 μL,置于10 mL 具塞玻璃离心管中,加入1 mol/L NaOH 溶液50 μL,涡旋2 min,加入4.0 mL 乙醚继续涡旋3 min,3 000 r/min 离心15 min,取上层有机相,氮气缓慢吹干,100 μL 乙腈复溶,3 000 r/min 离 心5 min,取20 μL 上清液,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。

2.7.3 线性关系考察 制备2 000 ng/mL 对照品溶液,乙腈依次稀释至1 000、500、250、100、25 ng/mL,分别精密量取500 μL,35 ℃氮气缓慢吹除有机溶剂,加入500 μL 空白血浆,涡旋5 min,得到25、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL血浆对照品溶液,按 “2.7.2” 项下方法处理后在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以延胡索乙素质量浓度为横坐标(X),峰面积纵坐标(Y) 进行回归,得方程为Y=0.206 9X+0.071 3 (r=0.993 8),在25～2 000 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.7.4 方法学考察取 “2.7.3” 项下25、1 000、2 000 ng/mL 血浆对照品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下各进样测定6 次,测得延胡索乙素峰面积RSD 分别为10.88%、7.03%、5.92%,表明仪器精密度良好。取上述3 种质量浓度的血浆对照品溶液,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,将测定含量与实际含量比较,测得延胡索乙素加样回收率在86.47%～92.72%之间,RSD 分别为6.38%、7.16%、5.06%。取血浆样品适量,于0、1、2、3、4、5 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,测得延胡索乙素峰面积RSD 为3.54%,表明样品在5 h 内稳定性良好。取“2.7.3” 项下25 ng/mL血浆对照品溶液,逐步稀释后在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定,测得定量限(S/N=10)、检测限(S/N=3) 分别为5、2 ng/mL。

2.7.5 结果分析 图5、表2 显示,与原料药比较,聚乳酸纳米粒tmax、t1/2延长(P＜0.05,P＜0.01),Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P＜0.01),相对生物利用度增加至2.41 倍。

图5 延胡索乙素血药浓度-时间曲线Fig.5 Plasma concentration-time curves for tetrahydropalmatine

表2 延胡索乙素主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

表2 延胡索乙素主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

注:与延胡索乙素比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

3 讨论

在制备难溶性药物纳米给药系统(如固体脂质纳米粒、纳米结构脂质载体、纳米混悬剂等)时,一般需借助高压均质机、超声仪等设备［4-5］,而且常使用二氯甲烷等有毒试剂［14］,导致其推广应用受到限制。本实验采用改良的溶剂扩散法制备延胡索乙素聚乳酸纳米粒,可避免使用有毒试剂或高能设备,具有一定的应用价值。

延胡索乙素生物利用度较低,可能与其体内不稳定［3］、体外溶出低、水溶性差［4］等因素有关。本实验中体外溶出结果显示,延胡索乙素聚乳酸纳米粒在各个时间点的累积溶出度均高于原料药混悬液；体内药动学结果显示,延胡索乙素聚乳酸纳米粒tmax显著延后,可能是由于其粒径较小,口服后容易吸附在肠壁,甚至进入绒毛间隙,增加滞留时间,从而延缓吸收［15-16］。同时,延胡索乙素半衰期显著延长,体内消除速度变慢,循环时间变长,其原因一方面可能是纳米粒改善了药物可润湿性；另一方面,泊洛沙姆188 吸附在纳米粒表面,在增加润湿性的同时也产生了空间位阻效应,可减少单核吞噬系统的吞噬,最终降低体内消除速度。另外,该成分相对生物利用度提高至2.41 倍,可能是由于(1) 纳米载体聚乳酸包裹药物后,有助于提高药物体内稳定性［15-18］；(2) 消除半衰期显著延长,增加药物体内循环时间；(3) 纳米级别的药物更容易通过肠道peyer’s patch 结进入血液循环,最终提高生物利用度［19］。今后,本实验将着重于延胡索乙素聚乳酸纳米粒药效学方面的考察［20-22］,以期为相关研究提供更为全面的资料。