一测多评法同时测定4 种中药注射液中9 种丹参酚酸

陈 影，吴 婷，姜 超，袭晓昀，张 倩，戴国梁，许美娟，居文政

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎,能活血祛瘀,主要用于治疗胸痹心痛,其有效成分有水溶性、脂溶性两类,前者主要包括丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸D 等。研究表明,丹参酚酸具有改善微循环［1］、抑制血小板聚集［2］、抗氧化［3］、增加冠脉流量［4］和心肌供氧量［5］等药理作用。

由于丹参水溶性成分的活血祛瘀功效良好,而且注射液起效迅速,疗效显著,故市场上出现多种含丹参水提物的中药注射液,但2020 年版《中国药典》 仅以丹酚酸B、迷迭香酸为其水溶性成分检测指标,难以保障丹参内在质量,具有一定的局限性；多指标质量控制模式需要较多种类的标准品,而且有一部分价格昂贵,稳定性差。

王智民［6］等提出利用一种相对易得、廉价的内参来实现多种成分同时测定的一测多评法,被认为适合于中药多指标质量控制与评价模式,已广泛应用于中药材［7-8］及中药制剂［9-10］的研究。目前,已有文献报道指纹图谱、一测多评等方法在含丹参制剂质量评价中的应用［11-12］,但尚未涉及丹酚酸E、丹酚酸D。因此,本实验采用一测多评法同时测定丹参注射液、丹红注射液、冠心宁注射液、香丹注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,以期为上述中药注射液的质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Waters e2695 型高效液相色谱仪 (美国Waters 公司)；Milli-Q Advantage A10 型超纯水机(美国Millipore 公司)；KH5200E 型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；CPA225D 型电子天平(德国Sartorius 公司)。

丹参素钠(批号180302-014)、紫草酸(批号180724-028)、原儿茶醛(批号13021902) 对照品均购于中国食品药品检定研究院；丹酚酸E (批号DST190507-065) 对照品购于成都德思特生物技术有限公司；丹酚酸D (批号12122305)、迷迭香酸(批号16040512)、丹酚酸B (批号13020104)、丹酚酸A (批号13020701) 对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司,纯度均大于98%。丹参注射液购自正大青春宝药业有限公司(批号1901183、1811203、1711052)；丹红注射液购自山东丹红制药有限公司(批号19031017、17091018)；冠心宁注射液购自亚宝药业集团股份有限公司 (批号181101)；香丹注射液购自国药宜宾制药有限公司(批号18100412)；维生素C 注射液购自华润双鹤利民有限公司(批号19040213)。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0～8 min,5%～13%A；8～14 min,13%～15% A；14～17 min,15%～23%A；17～22 min,23%～25% A；22～27 min,25%～27% A；27～30 min,27%～35% A；30～34 min,35%～5%A；34～38 min,5%A)；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；检测波长285 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 对照品适量,50%甲醇制成质量浓度分别为3.97、3.50、1.00、3.82、1.32、5.02、3.53、3.44、1.00 mg/mL,即得。

2.2.2 供试品溶液 取丹参注射液、丹红注射液、冠心宁注射液、香丹注射液适量,50% 甲醇稀释10 倍,并加入适量维生素C 注射液,12 000 r/min离心10 min,取上清,即得(含0.1%维生素C)。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验及峰纯度检测 取对照品、供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,各成分基本达到基线分离,分离度均大于1.5,理论塔板数以各成分计,均不低于5 000。同时,采用光电二极管阵列检测器对各成分进行紫外光谱扫描和峰纯度检测,发现除咖啡酸、丹酚酸E 含量低于定量下限外,其余成分紫外吸收光谱与相应对照品基本一致；除丹红注射液、香丹注射液中咖啡酸因含量过低,峰纯度因子低于900 外,其余成分均大于980。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量,制成6 个质量浓度,在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,并分别以S/N=3、S/N=10 为检测限、定量限,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次,测得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 峰面积RSD 分别为0.90%、0.83%、0.86%、0.65%、0.73%、0.81%、0.88%、0.67%、0.82%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取丹参注射液 (批号1901183)、丹红注射液(批号19031017)、冠心宁注射液 (批号181101)、香丹注射液 (批号18100412),按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得各成分峰面积RSD 均≤2.15%,表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取丹参注射液 (批号1901183)、丹红注射液(批号19031017)、冠心宁注射液 (批号181101)、香丹注射液 (批号18100412),按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,于 0、6、12、18、24、30、36、48 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得各成分峰面积RSD 均分别小于等于2.59%、2.34%、3.18%、2.71%、2.19%、2.51%、2.15%、2.95%、2.11%,表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的丹参注射液 (批号1901183)、丹红注射液(批号19031017)、冠心宁注射液(批号181101)、香丹注射液(批号18100412),精密加入适量对照品溶液,按“2.2.2” 项下方法各平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,丹参素平均加样回收率95.63%～101.62%,RSD≤2.92%；原儿茶醛平均加样回收率94.48%～106.08%,RSD ≤3.42%；咖啡酸(仅在丹参注射液、冠心宁注射液中) 平均加样回收率100.13%～109.07%,RSD≤5.61%；丹酚酸D平均加样回收率96.60%～101.82%,RSD≤2.93%；迷迭香酸平均加样回收率96.17%～102.29%,RSD≤2.66%；紫草酸平均加样回收率99.51%～102.57%,RSD≤4.89%；丹酚酸B 平均加样回收率95.21%～103.81%,RSD≤2.96%；丹酚酸E (仅在丹参注射液、香丹注射液中) 平均加样回收率90.37%～102.23%,RSD≤4.10%；丹酚酸A 平均加样回收率95.09%～102.41%,RSD≤5.16%。

2.4 相对校正因子测定 吸取“2.3.2” 项下对照品溶液适量,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以原儿茶醛为内标,分别采用斜率法、多点校正法计算其他8 种成分相对校正因子fk/s,公式为fk/s=fk/fs=(CkAs)/ (CsAk),其中Ck为其他成分含量,Ak为其他成分峰面积,Cs为内标含量,As为内标峰面积,结果见表2,可知2 种方法所得结果接近［相对误差(RE) ≤1.72%］。

2.5 耐用性考察

2.5.1 仪器、色谱柱 本实验考察了Waters 2695、Agilent 1100 色谱仪,以及Agilent ZORBAX SB-C18、Waters Symmetry C18、Thermo Syncronis C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 对相对校正因子的影响,结果见表3,可知均无明显影响(RSD≤4.75%)。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 进样体积、体积流量、柱温 本实验采用Waters 2695 色谱仪、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱,考察进样体积5、10、20 μL,体积流量0.8、1.0 mL/min,柱温25、30、35 ℃对相对校正因子的影响,结果见表4,可知均无明显影响(RSD≤1.40%)。

表4 不同进样体积、体积流量、柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different injection volumes，volumetric flow rates and column temperatures on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 吸取“2.2.1” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察“2.5.1” 项下色谱仪、色谱柱对相对保留时间的影响,结果见表5,可知均无明显影响(RSD≤3.17%)。

表5 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.7 样品含量测定 取3 批丹参注射液、2 批丹红注射液、1 批冠心宁注射液、1 批香丹注射液,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,分别采用外标法、一测多评法计算含量,结果见表6,可知2 种方法所得结果接近(RE≤4.78%)。

表6 各成分含量测定结果Tab.6 Results of content determination of various constituents

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验中有机相考察了乙腈、甲醇及其混合液,水相考察了甲酸、磷酸,发现以乙腈-0.1%磷酸洗脱时各成分色谱峰峰形良好,出峰时间早,基线平稳,故选择其作为流动相。前期关于丹酚酸类成分一测多评的文献中,柱长大多为250 mm［13］。又因在本方法下,待测色谱峰分离度良好,用时较短,故选择柱长为150 mm,可为丹参制剂的质量控制提供更多参考。

3.2 抗氧化剂选择 梁文仪［14］等报道,丹酚酸A在抗氧化、抗心肌缺血/再灌注方面均有明显药理活性,但该成分不稳定［15］,许多研究也不测定它在丹参制剂中的含量［16］。为更好地体现含丹参成分中药注射液的内在质量,本实验拟添加抗氧化剂以增强丹酚酸A 稳定性,参考文献［17-18］ 确定为维生素C,并考察了含0～0.5%该成分的丹参注射液在48 h 内的稳定性,发现其含量在不加维生素C 时于6 h 内减少了79%,而加入0.1%维生素C 后于48 h 内仅降低3.2%。

3.3 内标选择 由于原儿茶醛稳定性好,响应值高,而且价廉易得,故选择其作为内标［19］。另外,不同高效液相色谱仪对丹参素的响应差别较其他成分大［20］,应予以关注。

4 结论

本实验建立的一测多评法可同时测定丹参注射液、丹红注射液、冠心宁注射液、香丹注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,结果准确可靠。同时,该方法也可应用于丹参水溶性成分的质量控制,从而为全面评价该系列制剂的质量提供参考。